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第一部分 MYH13基因突变导致无虹膜症的分子机制研究无虹膜症（aniridia,AN）（MIM 617142）是一种虹膜组织部分或者完全缺损的遗传性眼病,可导致视觉敏锐度降低和眼球震颤。通常在婴儿时期发病,遗传方式以常染色体显性（AD）为主。课题组在上海采集到一个24人的无虹膜症大家系,其中患者9人。经全外显子测序,发现肌球蛋白重链13（mysion heavy chain 13,MYH13）发生了错义突变（c.542C>T（p.Ser180Tyr））。为了证实该基因突变的致病作用,我们构建了带有相同位置突变的质粒,转染到人HEK293细胞中,观察突变后细胞的形态和功能改变,结果显示,转入突变质粒后MYH13和PAX6的表达量均增高,而COXIV的表达量下降。电镜显示转染突变质粒的细胞中线粒体出现了空泡化现象。体外测定ATP发现突变组与正常组相比,细胞内ATP含量降低。蛋白结构模拟结果显示野生型为-181.80kcal/mol,Ser180Tyr突变型为-161.76kcal/mol,表明Ser180Tyr突变后与ATP的结合能力降低,这些证据都提示小鼠线粒体受损。此外,小鼠表达谱显示MYH13主要表达在眼外肌,脾和睾丸;小鼠眼球免疫组化也证明了MYH13蛋白主要表达在眼外肌中。在动物水平上,我们采用CRISPR/Cas9技术建立了带有与无虹膜症家系相同突变的基因敲入（Knock-in,KI）小鼠模型和造成MYH13蛋白功能缺失的敲除（Knock-out,KO）小鼠模型。对敲入小鼠模型的初步表型分析显示,野生型和杂合子小鼠在大小、体重、运动能力及眼睛观察方面均无明显差异;但杂合子与杂合子小鼠交配后,野生型:杂合子:突变纯合子小鼠的比例为3:5:1,不符合孟德尔遗传定律,其原因需要进一步观察与分析。血液生化指标结果显示三种基因型小鼠在血糖、血脂、肾功能方面没有明显差异;眼球HE染色显示三种基因型小鼠无明显差异,需进一步分析。第二部分PTC124用于Dhtkd1Tyr486*基因突变敲入小鼠模型的研究腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease,CMT）又称遗传性运动感觉神经病,是一类具有明显临床和遗传异质性的周围神经病,发病率约为1/2500。该病的遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X连锁显性或隐性遗传。课题组前期发现山东的一个CMT家系的脱氢酶E1和转酮醇酶结构域1（dehydrogenase E1 and transketolase domain containing 1,DHTKD1）基因存在一个无义突变[c.1455T>G（p.Tyr485*）],后被命名为CMT2Q。通过同源重组法获得了Dhtkd1 Tyr486*基因突变敲入小鼠模型。前期的表型分析结果表明,Dhtkd1Tyr486*基因突变敲入小鼠模型仅在微观结构及表达水平等方面出现了类似CMT2Q的表型。随后,课题组采用RNA芯片技术发现纯合子小鼠Dgkg基因（可催化分解甘油二酯）表达上调,而Lpin2（可合成甘油二酯）基因表达下调,同时血液生化指标显示纯合子小鼠的TG、TCHO含量降低（p均<0.05）,提示敲入小鼠可能通过提高脂代谢率来维持因Dhtkd1缺乏导致的能量不足。我们采用促无义突变通读的药物PTC124对小鼠进行给药实验,发现连续注射药物（30ug/g/d和60ug/g/d）两周后小鼠体内RNA水平上Dhtkd1和Dgkg的表达量均上调,但Lpin2表达量下调（p<0.05）;蛋白水平提示使用30ug/g/d浓度时能翻译出Dhtkd1蛋白,体外检测结果显示使用30ug/g/d浓度时小鼠血清中甘油二酯含量上调,磷脂酸下降（p<0.05）,提示PTC124对Dhtkd1 Tyr486*基因突变敲入小鼠模型有一定的作用。