铁皮石斛复方对db/db小鼠代谢异常的膳食干预效果及其多组学分析研究

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铁皮石斛具有抗氧化、降糖及降脂等功效,利用配伍技术研制铁皮石斛复方对其产业发展意义重大。本研究以铁皮石斛、枸杞和西洋参为原料,提取分离获得铁皮石斛复方,研究其对糖尿病小鼠的血糖调控作用效果及其相关分子机制,并进一步通过柱分离技术筛选活力最强的组分,为后续深入的体内活性研究奠定物质基础。(1)设置正常对照组、模型对照组、盐酸二甲双胍组(MET)、铁皮石斛复方低剂量组(LDOE)及高剂量组(HDOE),灌胃db/db糖尿病小鼠,每周定期监测动物体重和血糖。结果表明:与模型对照组相比较,连续饲喂LDOE及HDOE的db/db小鼠的空腹血糖水平在第10周开始出现显著降低(p<0.05);HDOE能显著增加胰岛素分泌(p<0.05),但血脂四项及胰岛素抵抗指数无明显变化;组织病理学检查结果显示,铁皮石斛复方能轻微改善db/db糖尿病小鼠胰腺组织中胰岛数量及胰岛β细胞减少的情况。(2)我们首先利用RNA-Seq转录组测序方法初步分析了小鼠肝脏组织的基因表达情况,结果表明:与模型对照组相比,LDOE和HDOE处理组能通过显著下调TNF-α、LEP、CD34、CD8、CD20、CCL21、LEP、XCL1及上调CD121、CD114、IL22RA1、IL1R2等基因来调控小鼠的血糖水平(p<0.05);与模型对照组相比,HDOE能显著干预非酒精性脂肪肝(NAFLD)信号通路(p<0.05),暗示HDOE可能通过NAFLD信号通路来显著下调TNF-α、LEP和Adipoq等基因及上调PPARα、IRS-1、IRS-2、AP-1和IL-1等基因,从而更有效地降低了小鼠的血糖水平(p<0.05),下一步将通过反转录PCR(RT-PCR)及蛋白质印迹法(Western Blot)对转录组结果进行验证。(3)随后,我们利用16s rDNA测序方法分析了小鼠的粪便样品,结果显示:铁皮石斛复方改变了小鼠肠道菌群的结构组成,比如模型对照组中厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)为1.05,LDOE与HDOE处理后分别为0.48与0.35,说明铁皮石斛复方可能通过改善F/B比值从而调控血糖水平;HDOE与模型对照组在种属水平上的对比显示,组间差异菌群主要为Prevotellaceae、Mucispirillum、Lactococcus、Alloprevotella、Alistipes及Rikenellaceae等,它们均属于能正向调节NAFLD、糖脂代谢和抗炎相关的菌群,这与小鼠肝脏内NAFLD信号通路、糖脂代谢基因(PPARα、IRS-1、IRS-2)及炎症相关基因(TNF-α、AP-1和IL-1)显著变化的结果相符。(4)为进一步筛选出铁皮石斛复方这种调控作用的物质基础,我们最后对其活性成分进行了分离纯化研究,即分别用水、30%乙醇、50%乙醇和100%丙酮等溶剂通过MCI凝胶柱分离纯化该复方得到A、B、C、D四个组分,对铁皮石斛复方及其四个组分进行多酚、黄酮及多糖含量和抗氧化能力检测,结果显示:各组多糖含量变化不大,多酚主要富集在B、C组中,黄酮主要富集在B、C、D组中;DPPH抗氧化能力排序为C>B>D>铁皮石斛复方>A,ABTS抗氧化能力排序为B>D>铁皮石斛复方>C>A;组分C的ORAC值最高,为153.41±2.32μmol TE/g,说明多酚和黄酮是抗氧化作用的主要贡献者。相关性结果分析表明,铁皮石斛的主效成分有可能是多酚或黄酮,而非单纯的铁皮石斛多糖。
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