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北沙参为多年生草本植物,在栽培群体中存在着丰富的遗传变异。在生产和使用上人们根据其叶片形状、叶柄颜色、根条粗壮程度等将北沙参划分为:大红袍、白条参、红条参三个栽培品种。关于它们之间在分子水平上的遗传关系研究较少,而且在长期的栽培过程中,由于不注意品种的保护和相关育种工作的滞后,各品种混杂退化严重。本研究将SRAP这种新的DNA分子标记运用到北沙参遗传多样性的研究上,以期在分子水平上明确各品种间的亲缘关系,为北沙参品种的提纯和科学利用提供依据。
试验以莱阳北沙参为材料,首先按照传统分类方式划分品系,提取了北沙参基因组DNA;同时建立优化了北沙参SRAP分子标记体系,并将该技术体系应用于83个北沙参材料的SRAP扩增分析中。试验具体结果如下:
1、按照传统分类方法,将所采集北沙参群体样本划分为白条参、红条参、大红袍、花参四大类,并按类群编号。
2、采用改良CTAB法提取北沙参基因组DNA,并对所提取的DNA进行了纯化处理。纯化后的DNA条带明亮整齐,无拖尾显现,质量高。提取的DNA经过进一步纯化后,有效的解决了北沙参基因组DNA多酚、蛋白质、多糖等杂质含量高的问题,使的该DNA模板更加适合SRAP标记分析。
3、建立并优化了适用于北沙参基因组DNA标记分析的SRAP技术体系。
试验以北沙参DNA为模板,通过DNA、dNTPs、Mg2+、Primer、Taq polymerase的浓度梯度试验,对北沙参SRAP反应体系进行了优化,建立了稳定可靠的北沙参SRAP-PCR反应体系;反应体系20μL: DNA80ng、 Mg2+2.5mmol/L、dNTPs0.25mmol/L、Taq polymerase 1U、正反向Primer均为0.1μmol/L。
所确定的SRAP反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min、35℃复性1min、72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min、50℃复性1min、72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸10min,10℃保存。
4、引物的筛选及北沙参基因组DNA的SRAP扩增
利用已经优化好的体系,从240对引物中筛选出条带清晰,稳定性、多态性好的引物24对,共扩增出114条清晰带,平均4.75条;其中多态性条带77条,平均每对引物扩增出3.21条多态性条带,多态性比率为67.5%。
利用所筛选出的引物对83个北沙参DNA模板进行SRAP扩增,得到了稳定的SRAP扩增条带,这些条带反应出了各样本基因组DNA碱基序列的特异性,说明这些引物可用于其它分析。
5、采用NTSYS-pc2.11a聚类分析软件中的遗传相似系数和UPGMA法,对扩增出的位点进行遗传聚类分析,得出反应各样本间亲缘关系的树状图。在遗传相似系数0.79处,将样本划分为3个大类和13个特异样本,各品系成簇分布明显,虽然有交叉现象存在,但是总体上看,基本符合传统的分类体系。特异单株的存在也说明了在实际栽培过程中确实存在众多的中间类型。