研究背景瘢痕疙瘩(Keloid)是皮肤损伤异常愈合后的结果,以纤维基质过度沉积为主要特点,生长面积常超出损伤范围,呈肿瘤样侵袭性生长,并伴随疼痛瘙痒等症状,严重影响容貌,常导致患者严重的身心健康障碍。目前Keloid形成机制研究仍未取得突破性进展,因外科切除、药物以及放射治疗均不能达到良好的治疗效果,且容易复发,这一问题亟需解决。近年来,干细胞的相关研究涉及多个领域,因其具有多向分化能力,在特定的诱导条件下可分化成为目的细胞修复损伤和功能萎缩的组织,使之成为研究热点,且Moon等[1]在2008年从Keloid中分离出一类具有增殖分化潜能的多能干细胞KMLSCs(Keloid-derived mesenchymal stem cells),这些细胞通过失控性自我更新、增强细胞增殖和药物抵抗而实现调控Keloid的致病过程[1-3],但是具体的致病机制尚不甚清楚。骨母特异性因子2(osteoblast-specific factor 2,Periostin),是细胞外基质中具有中轴意义的因子,主要参与肿瘤局部基质干细胞功能的维持,阻断Periostin,可抑制肿瘤转移。既往研究发现,Periostin在瘢痕中的表达明显高于正常皮肤,可能与瘢痕形成相关,该蛋白异位表达,可促进MSCs(Mesenchymal stem cells)迁移、侵袭、附着等[4,5]。在对胃癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的相关研究中发现,Periostin与肿瘤的恶性程度和转移之间存在密切联系,这说明Periostin可能是肿瘤形成过程中一个重要分子。此外,研究表明Periostin可促进脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,hADSCs)、人角膜干细胞(human limbal stem cells,h LECs)以及神经干细胞(neural stem cells,NSCs)等[6-8]的增殖,抑制凋亡从而参与相关组织器官癌变过程,但是Periostin是否调控瘢痕疙瘩微环境内间充质干细胞的增殖而参与瘢痕疙瘩的发病过程尚不清楚,故研究Periostin与KMLSCs之间相互关系在瘢痕疙瘩发生发展中作用尤为重要。目的探讨Periostin对瘢痕疙瘩间充质干细胞体外增殖的影响。方法1.临床标本选择标准年龄在5~30岁之间,性别不限;在我科明确诊断为“瘢痕疙瘩”者;无心、肝、脾、肺等系统的器质性病变;无其他系统的纤维性病变;首次进行瘢痕治疗;瘢痕疙瘩和正常皮肤均来自同一个体。2.瘢痕疙瘩干细胞(KMLSCs)的分离将西南医院整形科提供的无菌瘢痕疙瘩组织以及同体正常皮肤组织分为两组,即瘢痕疙瘩组和同体正常皮肤组,结合组织培养法和消化法,在相同条件下分离瘢痕疙瘩和同体正常皮肤组织的细胞,干细胞专用培养基终止消化后,加入培养基直接进行贴壁培养,在光学显微镜下观察细胞的形态和均一程度,通过酶消化法传代培养至第3代后,利用细胞免疫荧光技术和流式细胞术进行鉴别,最后通过流式细胞术进行干细胞分选,获得具有活性的目的干细胞。3.Periostin对KMLSCs增殖影响的体外实验研究利用Western blot、免疫组织化学技术检测瘢痕疙瘩和同体正常皮肤组织中Periostin蛋白的表达差异,通过Western blot、q PCR、免疫细胞化学技术进一步验证KMLSCs和真皮干细胞中Periostin的表达同在同体组织中的表达水平是否一致,然后通过体外构建目的基因的慢病毒干扰表达载体,对目的基因的表达进行人为干预,利用q PCR、Western blot检测细胞的干扰效率,最后通过MTT、流式细胞术、免疫荧光技术和激光共聚焦技术对细胞的增殖强度、周期与凋亡变化情况以及下游相关分子蛋白LRP5的表达进行检测,阐明Periostin基因对瘢痕疙瘩干细胞增殖的作用,以及可能的机制。结果1.成功从瘢痕疙瘩组织中分理处瘢痕疙瘩间充质干细胞(KMLSCs)。细胞免疫荧光共聚焦检测干细胞标志物发现,分离培养的细胞瘢痕疙瘩间充质干细胞和真皮干细胞均阳性表达CD73,CD90和CD105,阴性表达CD34和CD45,进一步通过流式细胞术检测与分选,CD73+CD90+CD34-的瘢痕疙瘩间充质干细胞纯度高达95.1%,真皮干细胞纯度达到94.9%,符合国际骨髓间充质干细胞的认定标准;2.成功分离出干细胞后,利用细胞免疫化学技术和Western Blot检测,结果发现瘢痕疙瘩间充质干细胞中Periostin的表达明显强于其所对应的同体真皮干细胞中的表达(P<0.05);3.构建Periostin基因的慢病毒干扰表达载体并感染KMLSCs。利用qPCR、Western blot技术检测感染效率。结果显示,与空载体组和未转染组相比,干扰组Periostin的表达显著降低。5.MTT结果示,敲低Periostin可显著抑制体外KMLSCs的增殖(P<0.05),流式细胞术检测发现,同空载体组和未转染组相比较,敲低Periostin基因可促进KMLSCs凋亡,并显著延长KMLSCs的细胞周期;6.免疫荧光检测结果示:在KMLSCs中敲低periostin基因后,明显抑制Wnt信号通路中的LRP5蛋白分子的表达(P<0.05)。结论1.瘢痕疙瘩组织微环境中可分离培养出间充质干细胞,这些干细胞均阳性表达CD73,CD90,CD105,几乎不表达CD34和CD45,符合国际骨髓间充质干细胞的认定标准;2.瘢痕疙瘩间充质干细胞中Periostin的表达显著高于同体真皮干细胞(P<0.05);3.Periostin基因慢病毒干扰表达载体可有效干扰Periostin基因表达;4.干扰Periostin基因后,可有效抑制KMLSCs增殖能力,促进细胞凋亡,延长细胞周期;5.干扰Periostin基因后,可引起Wnt信号通路中辅助受体LRP5蛋白的表达减弱。