论文部分内容阅读
背景：胶质瘤占中枢神经系统肿瘤的40%左右,即使经过广泛切除、放射治疗和化学治疗后,病变仍然具有局部侵袭性,容易复发。并且,高级别胶质瘤(间变型星形细胞瘤WHOm;多形性胶质母细胞瘤WHOW)患者的预后情况依然不佳。因此,临床上期待有更加行之有效的治疗方式。MicroRNA(miRNA)是一类高度保守、长度很短的非编码调控单链RNA,约20nt-24nt,通过与目标mRNA互补配对导致mRNA降解或抑制转录后翻译诱导基因沉默。miRNA参与生命过程中一系列的重要进程,包括发育、造血、器官形成、细胞增殖和凋亡、癌症的发生、发展。目前,大量研究表明miRNA在肿瘤细胞对化疗药物的耐药机制中扮演了重要的角色。目的：本研究通过检测胶质瘤细胞株U251及顺铂耐药株U251/CDDP的microRNA的表达差异,探讨microRNA与胶质瘤化疗耐药的关系及机理。方法：1、应用人胶质瘤细胞株U251,采用顺铂剂量梯度爬升筛选方法,诱导耐药胶质瘤细胞株；MTT法检测U251/CDDP相对于其亲代细胞U251的耐药性和耐药倍数；应用microRNA表达谱芯片对人胶质瘤细胞系U251及其耐药模型251/CDDP的microRNA表达谱进行检测,筛选出人胶质瘤耐药相关的microRNA;应用real-timePCR方法对microRNA表达谱芯片检测出的差异表达microRNA进行验证；应用化学合成法对筛选出的差异表达microRNA进行体外合成,转染至U251、U251/CDDP耐药模型,观察其对逆转耐药性的作用。2、转染let-7b类似物至U251、U251/CDDP细胞,应用Western-blot检测凋亡相关蛋白和分子Bcl-2、Bax、Caspase-3水平；Annexin-FITC染色检测细胞凋亡；流式细胞仪检测细胞周期变化；通过生物信息软件预测let-7b的靶基因,确定let-7b的靶基因是CCND1, Western-blot检测转染后CCND1、ppRb蛋白质的改变情况；在U251、U251/CDDP细胞中,通过Western-blot检测siRNA-CCND1转染后的CCND1、ppRb蛋白表达情况,Annexin-FITC染色检测细胞凋亡；流式细胞仪检测细胞周期变化。结果：1、我们诱导获得的耐药胶质瘤细胞株U251/CDDP对顺铂半数抑制浓度(IC50)较亲代U251增加了3.1倍分别是1.4±0.1ug/ml,4.4±0.9ug/ml)。microRNA芯片的结果显示耐药株U251/CDDP与亲代细胞系U251比较有23个microRNA高表达,34个microRNA低表达；RT-PCR的结果进一步证实miR-182、miR-224在U251/CDDP中显著上调,而Let-7b、miR-125b、miR-107、miR-203在U251/CDDP中显著下调。在U251细胞中,联合-应用let-7b、miR-125b、miR-107、miR-203、miR-182、miR-224和化疗药物cisplatin(CDDP)的IC5o分别为0.63±0.09、1.47±0.06、1.33±0.07、1.1±0.02、1.17±0.10、0.77±0.07ug/ml;在U251/CDDP细胞中,联合应用let-7b、 miR-125b、miR-107、miR-203、miR-182、miR-224和化疗药物cisplatin(CDDP)的IC50分别1.62±0.03、5.52±0.47、5.87±1.56、3.72±0.96、2.58±0.22、2.74±0.59ug/m1。基于Ic50值,在U251、U251/CDDP细胞中,转染let-7b使其对化疗药物的敏感性提高2—3倍。综合前面的结果,我们得出在U251、U251/CDDP中的microRNA表达存在差异,let-7b在胶质瘤耐药机制中可能发挥着重要的作用。1、过表达let-7b对Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表达无明细影响；联合应用let-7b和化疗药物顺铂可显著抑制Bcl-2的表达,增加Bax的表达,使caspase-3活性显著增加,从而促进了细胞的凋亡；let-7b引起GO/G1期停滞,促进细胞的凋亡；Let-7b和siRNA-CCND1均可抑制CCND1和ppRb的蛋白表达,而siRNA-CCND1亦可引起G0/Gl期停滞,促进细胞凋亡。结论：1、U251/CDDP和U251的microRNA的表达存在着差异,提示microRNA参入胶质瘤化疗耐药,为进一步研究microRNA在胶质瘤耐药机制中的作用打下基础。2、转染let-7b的类似物至U251、U251/CDDP细胞系可以增加U251、U251/CDDP的化疗敏感性。3、Let-7b可能通过调节其靶基因CCND1的蛋白表达,调节U251、U251/CDDP细胞对化疗药物的敏感性。4、成功构建了靶向CCND1的siRNA表达载体,si-CCND1可以抑制CCND1、ppRb蛋白的表达,产生G0/G1阻滞并诱导凋亡。