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第一部分脑出血后TDP-43的蛋白水平及分布变化目的:研究大鼠脑出血(ICH)后血肿周围脑组织中TDP-43蛋白水平;Pi化及分布的变化。方法:随机任选42只大鼠分为假手术组和ICH后3h、6h、12h、24h、48h、72h共7组,每组6只。所有的大鼠在脑出血后相应的时间点被处死。在每组大鼠取血肿周围1.5-2mm范围内脑组织,分离核蛋白与胞浆蛋白,利用免疫荧光和Western blot技术分析检测TDP-43的蛋白水平,Pi化及分布情况。结果:1、实验结果表明,大鼠脑出血后神经元细胞核中TDP-43水平呈先下降后恢复再下降再稍恢复的变化,以ICH后48h组TDP-43核定位下降最显著(P<0.01);2、神经元胞浆内TDP-43水平在ICH后逐渐上升的趋势,在48h达到最高值(P<0.01),随后开始下降;3、胞浆内TDP-43磷酸化水平在ICH后逐渐上升,并在48h达到最高值(p<0.01),随后下降。4、体内与体外的免疫荧光显示TDP-43在脑出血模型48h后核定位达到最低水平,与此同时其在胞浆分布达到最高水平(P<0.01)。结论:ICH后TDP-43开始从神经元的细胞核内转移到细胞质中,并于出血后的48h TDP-43的胞浆内磷酸化水平及核丢失达到最高。第二部分调控TDP-43对脑出血后继发性脑损伤的影响目的:探索TDP-43磷酸化位点S409/410突变试剂干预后,TDP-43在脑出血后细胞内分布表达变化,及TDP-43突变干预对大鼠脑出血诱发的继发性脑损伤中的保护作用。方法:在体内实验中,任选84只,随机分为假手术组(sham)、脑出血组、脑出血+空质粒组(ICH+vector)、脑出血+TDP-43质粒组(ICH+TDP-43WT)、脑出血+TDP-43突变组(ICH+TDP-43MT)、脑出血+control RNA组(ICH+control RNA)、脑出血+TDP-43小干扰RNA组(ICH+TDP-43 si RNA),共计7组(n=12/组)。在转染TDP-43质粒与小干扰RNA后48h于基底节区注射心脏自体血80ul,48h后取出脑组织做切片进行TUNEL染色、Fluoro-Jade B(FJB)染色;每组取6只大鼠的血肿周围脑组织分离胞浆蛋白及核蛋白进行Western Blot分析和免疫荧光分析。在体外实验中,胎鼠中提取培养神经元,随机分为control组、oxy Hb组、oxy Hb+vector组、oxy Hb+TDP-43WT、oxy Hb+TDP-43MT、oxy Hb+control RNA组、oxy Hb+TDP-43si RNA组,共计7组(n=6/组),进行LDH分析。结果:1、Western Blot实验结果表明,ICH能够促进TDP-43磷酸化(p<0.05),突变TDP-43磷酸化位点S409/410能够显著降低其磷酸化水平(p<0.05)。2、过表达TDP-43突变体能够显著减少TDP-43在脑出血后胞浆内聚集情况(p<0.05),减少核丢失(P<0.001)。3、在体内FJB、TUNEL染色及体外LDH表明:过表达TDP-43突变体可以显著降低在脑出血后神经元的凋亡坏死情况(p<0.05)。结论:1、S409/410是TDP-43重要的Pi位点;2、通过突变TDP-43的磷酸化位点S409/410可以减少其在脑出血后的核丢失,改善脑出血所诱导的继发性脑损伤。第三部分TDP-43参与脑出血后继发性脑损伤的机制研究目的:通过对CN活性的检测来验证其在ICH情况下对TDP-43磷酸化水平的影响;通过磷酸化位点突变技术研究TDP-43潜在的脑保护作用机制。实验方法:在体外实验中通过CN活性试剂盒来测定脑出血及相关干预状态下CN的活性及TDP-43磷酸化水平的变化。在体内实验中,任选30只,随机分为假手术组(sham)、脑出血组、脑出血+DMSO组、脑出血+FK506组、脑出血+CHA组,共计5组(n=6/组),通过Western Blot分析来观察各相关蛋白水平。结果:1、体外实验表明:脑出血后钙调磷酸酶(CN)活性增加,CHA能促进其活性,相比之下FK506能抑制其活性;脑出血后CHA能抑制TDP-43的磷酸化,与此同时FK506能够促进TDP-43的磷酸化。2、体内Western blot实验结果表明:脑出血干预TDP-43突变体后m-TOR及DCTN1的蛋白表达水平显著增加(p<0.05)。3、脑出血后自噬水平较假手术组显著提高(p<0.05),干预TDP-43突变体后自噬水平较正常脑出血组明显降低(p<0.05)。结论:脑出血后钙调磷酸酶(CN)的活性增加,能够促进PITDP-43的去磷酸化,CHA,FK506可以分别起到促进、抑制作用;突变TDP-43的磷酸化位点S409/410可以增加m-TOR的的蛋白表达从而降低自噬小体与溶酶体的生物学效应,在DCTN1的蛋白表达水平增高的情况下,降低了自噬水平,起到改善了继发性脑损伤作用。