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【研究目的】糖尿病性溃疡是糖尿病患者在合并周围神经和血管病变的基础之上发生的以局部皮肤破溃为特征的频发而棘手的糖尿病性慢性创面。虽然,临床上有标准化的治疗方案,如控制血糖、改善局部血液循环、控制感染和清除坏死组织等,但仍有7-20%的糖尿病性足部溃疡患者需要截肢。因此,对糖尿病性溃疡进行有效管理、开发新的治疗方法,提高创面修复能力,促进糖尿病创面愈合具有重大临床和社会意义。人羊膜上皮细胞（hAECs）位于羊膜最内层,属于胚胎干细胞,具备非致瘤性、低免疫原性、免疫调控、易大量获取及不受伦理学限制等优势。本课题组前期研究结果证实,冻存活性羊膜微粒和新鲜人羊膜上皮细胞均可通过调控创面局部微环境或血管化过程,促进糖尿病创面愈合,但具体机制尚不明确。外泌体是几乎所有细胞都能够分泌的一种细胞外囊泡,其形成过程中选择性装载功能或非功能性的脂质、蛋白质、遗传物质等,是实现细胞间信号传递的重要载体之一。大量研究证实,外泌体机制可能是干细胞发挥组织/器官再生作用的重要途径。本文就hAECs-Exos对高糖环境下创面愈合相关细胞功能及糖尿病创面愈合的作用及相关机制进行探索,以期为糖尿病创面有效管理提供新策略。【研究方法】1.hAECs分离和鉴定（1）获取、清洁羊膜组织,胰酶分次消化法获取hAECs;（2）倒置显微镜、流式细胞术对hAECs大体观和细胞表型进行鉴定;（3）定向分化实验及细胞免疫荧光技术鉴定hAECs干细胞特性。2.hAECs-Exos分离和鉴定（1）收集hAECs培养上清,超速离心法获取hAECs-Exos;（2）透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察外泌体大体观;（3）动态光散射（Dynamic Light Scattering,DLS）检测外泌体粒径分布;（4）流式细胞术（Flow Cytometer,FCM）鉴定外泌体表面标记蛋白。3.hAECs-Exos调控创面高糖环境下创面愈合相关细胞功能创面愈合相关细胞（成纤维细胞/表皮细胞/血管内皮细胞）随机分为hAEC-Exos组和对照组（PBS组）:（1）CCK-8检测hAECs-Exos对创面愈合相关细胞增殖活性的影响;（2）Transwell和划痕实验评估hAECs-Exos对创面愈合相关细胞迁移能力的影响;（3）小管形成实验观察hAECs-Exos对HUVECs体外成管能力的影响。4.hAECs-Exos促进糖尿病创面愈合速度1%戊巴比妥钠（0.1ml/20g）腹腔麻醉糖尿病小鼠,于每只糖尿病小鼠背部脊柱两侧制备直径6mm全层皮肤缺损创面。随机分为hAEC-Exos组和对照组（PBS组）。定时拍照记录创面愈合大体观并统计不同时间点创面愈合率。5.hAECs-Exos通过激活PI3K-AKT-m TOR通路提升高糖环境下创面愈合相关细胞功能（1）高通量测序预测hAECs-Exos-mi RNAs靶基因功能富集通路,并通过WB实验在创面愈合相关细胞内进行验证;（2）创面愈合相关细胞随机分为hAEC-Exos+DMSO组、PBS+DMSO组和hAEC-Exos+LY294002组:（1）WB实验验证各组PI3K-AKT-m TOR通路激活或抑制情况;（2）CCK-8、Transwell和划痕实验分别评估实验各组组创面愈合相关细胞增殖活性及迁移能力;（3）小管形成实验观察实验各组HUVECs体外成管能力。6.hAECs-Exos通过激活PI3K-AKT-m TOR提升糖尿创面愈合速度及质量1%戊巴比妥钠（0.1ml/20g）腹腔麻醉糖尿病小鼠,于每只糖尿病小鼠背部脊柱两侧制备直径8mm全层皮肤缺损创面。随机分为hAEC-Exos+DMSO组、PBS+DMSO组和hAEC-Exos+LY294002组:（1）定时拍照记录创面大体观并统计不同时间点创面愈合率;（2）H＆E、Masson染色观察愈合创面皮肤组织的病理学结构;（3）免疫组织化学染色和天狼猩红染色评估实验各组创面组织血管化,细胞增殖状态及细胞外基质胶原沉积。【研究结果】1.胰酶分次消化法获得的hAECs呈卵圆形,胞质丰富,大小均一,呈典型的鹅卵石样单层排列,上皮样细胞形态显著。高表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD90及CD29,不表达CD34及HLA-DR。同时,hAECs可以向骨组织、软骨组织及脂肪组织诱导分化,高表达胚胎抗原SSEA-3,SSEA-4及维持胚胎干细胞多潜能性和自我更新极其重要的转录因子Oct-4;2.超速离心法获得的hAECs-Exos呈球状、圆盘状或杯口状,粒径主峰位于100nm附近,外泌体表面Marker CD63和TSG101呈强阳性;3.hAECs-Exos能够促进高糖环境下创面愈合相关细胞的增殖、迁移和HUVECs体外成管功能;4.hAECs-Exos创周局部注射可以缩短糖尿病小鼠创面愈合时间;5.hAECs-Exos-mi RNA靶基因高度富集于PI3K-AKT-m TOR信号通路;6.hAECs-Exos可以激活高糖环境下创面愈合相关细胞内PI3K-AKT-m TOR信号通路。当该通路被阻断时,hAEC-Exos对高糖环境下创面愈合相关细胞的调控作用将部分被抑制;7.hAECs-Exos可以激活糖尿病小鼠创面组织内PI3K-AKT-m TOR信号通路。当该通路被阻断时,hAEC-Exos介导的促进糖尿病创面愈合速度和愈合质量的功能将部分被抑制。【研究结论】1.胰酶分次消化法可以成功获得高纯度、高特异性的hAECs;2.超速离心法能够成功分离满足实验需求的一定质和量的hAECs-Exos;3.hAECs-Exos通过提高高糖环境下创面愈合相关细胞的功能,进而加快糖尿病创面的愈合速度,改善糖尿病创面的愈合质量;4.PI3K-AKT-mTOR介导hAEC-Exos对高糖环境下创面修复细胞功能及糖尿病创面愈合速度和愈合质量的影响;5.hAEC-Exos治疗有望成为一种有前途的糖尿病创面治疗新策略。