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背景和目的多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)的慢性炎症性自身免疫性疾病。该病好发于青中年,女性多见,其临床表现复杂,多为运动功能障碍,严重者可导致瘫痪,是中青年人神经性伤残的主要原因之一。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)与MS的病理特征相似,是研究人MS常用的动物模型。MS的发病机制尚不十分明确,临床上常用免疫抑制剂和激素控制疾病的进展,但免疫抑制剂和激素的长期服用也给患者带来严重的不良反应。冬凌草甲素(oridonin,ORI)是一种四环素二萜类化合物,是冬凌草的主要活性成分,具有抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。文献报道,冬凌草甲素治疗可改善实验性自身免疫性神经炎的临床症状。前期研究发现冬凌草甲素可预防和治疗EAE,但作用的分子机制尚不清楚。本研究探究冬凌草甲素治疗EAE的分子机制,寻找冬凌草甲素作用靶点,为冬凌草甲素用于临床治疗MS提供新的思路和理论依据。方法本研究采用C57BL/6小鼠两侧背部MOG肽皮下免疫建立EAE模型,小鼠随机分为对照组(EAE组)和冬凌草甲素治疗组(ORI组)。ORI组在免疫后的第3、5、7天腹腔注射15 mg/kg/d的冬凌草甲素,EAE对照组腹腔注射等量的PBS,每天观察各组小鼠的发病情况。通过临床评分、组织病理变化以及CNS细胞计数等手段分析冬凌草甲素对EAE的治疗作用;通过流式细胞术检测两组小鼠脾脏T细胞(CD4+和CD8+T细胞)、巨噬细胞(CD1 1b+)和B细胞(CD19+)的比例,以及MOG反应性CD4+T细胞的增殖研究冬凌草甲素作用的细胞亚群;通过流式细胞术检测两组小鼠脾脏Th1、Th2、Th17和Treg细胞表达,ELISA检测上述细胞分泌的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的浓度探究冬凌草甲素对T细胞亚群的调节作用;应用western blot检测NF-κB/p65、p-p65、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、c-fos、p-c-fos、c-jun、p-c-jun 和 p-mTOR 蛋白的表达,研究冬凌草甲素对NF-κB、MAPK和mTOR信号通路的作用;通过比色法检测钙调磷酸酶活性,流式细胞术检测NFAT表达,ELISA检测IL-2浓度以及RT-PCR检测IL-2mRNA表达,研究冬凌草甲素对钙调磷酸酶-NFAT信号通路的作用;通过Ras活性检测试剂盒检测Ras活性、流式细胞术分析IL-2受体CD25的表达,研究冬凌草甲素对Ras信号通路的作用。结果1、冬凌草甲素治疗EAE:MOG肽免疫第8天小鼠开始发病,发病率为100%,初始症状表现为尾部无力,继而尾巴瘫痪,第17天进入发病高峰期,表现为双后肢甚至四肢瘫痪,严重者可导致死亡;冬凌草甲素治疗后小鼠发病时间明显延迟,第12天开始发病,以尾部无力为主,无小鼠累及后肢。EAE对照组小鼠CNS可见大量的炎性细胞浸润。与EAE组相比,ORI组CNS浸润单个核细胞数量显著减少。2、冬凌草甲素抑制CD4+T细胞增殖:冬凌草甲素治疗后脾脏和CNS中的CD4+T细胞比例减少,巨噬细胞、CD8+T细胞、B细胞比例无明显变化;冬凌草甲素可抑制脾脏MOG反应性CD4+T细胞增殖。3、冬凌草甲素调节T细胞亚群:髓鞘特异性Th1、Th17细胞是EAE主要的致病细胞。冬凌草甲素治疗显著抑制脾脏Th1、Th17细胞分化,但对Th2和Treg细胞无明显作用。冬凌草甲素治疗抑制炎性细胞因子IFN-γ、IL-17分泌,对抗炎细胞因子IL-4和IL-10无明显作用。4、冬凌草甲素抑制NF-κB、MAPK和mTOR信号通路的活化:NF-κB信号通路在炎症反应和免疫应答过程中起关键作用。MAPK信号通路参与细胞的增殖、分化等多个细胞程序,在T淋巴细胞活化和Th1、Th17分化中发挥重要作用。mTOR信号通路与T细胞增殖密切相关,调节细胞的生长、代谢与自噬。western blot结果显示:冬凌草甲素治疗后NF-κB、MAPK和mTOR信号通路相关蛋白的磷酸化均受到抑制。5、冬凌草甲素对钙调磷酸酶信号通路无影响:钙调磷酸酶-NFAT信号通路在T细胞的增殖、分化等过程中发挥关键作用。比色法和流式结果显示,冬凌草甲素对钙调磷酸酶活性及其下游NFAT的转录无影响。但ELISA、RT-PCR结果均表明冬凌草甲素可上调IL-2表达。6、冬凌草甲素靶向IL-2-IL-2R-Ras信号通路治疗EAE:IL-2又叫T细胞生长因子,与淋巴细胞的增殖、分化有关。IL-2与IL-2受体(CD25)相互作用,启动下游Ras活化,Ras可调控下游NF-κB、MAPK和mTOR信号通路。pull down实验结果显示,冬凌草甲素可抑制Ras活性。流式细胞术进一步证明冬凌草甲素可抑制IL-2受体CD25的表达。结论冬凌草甲素通过靶向CD25抑制IL-2/IL-2R介导的Ras活化,抑制NF-κB、MAPK和mTOR信号通路活化,从而抑制T细胞增殖、Th1和Th17细胞分化以及炎症因子表达治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎。