噬菌体KS461-2部分特性及全基因组分析

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2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid,2KGA)是化学合成食品抗氧化剂D-异抗坏血酸及其钠盐的前体,在大规模工业生产上通常采用细菌发酵方法由D-葡萄糖转化而来。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)A46是以K1005菌株为出发菌株,经紫外诱变选育的2KGA高产菌株,其发酵周期短,转化率高,对噬菌体KS502、503抗性稳定,在国内2KGA工业生产中得到普遍采用。在近年来国内2KGA的工业生产中,该菌株遭受了新的噬菌体侵染,发酵生产出现异常,给生产企业带来了很大的经济损失。噬菌体种类繁多,且分布广泛。因此,在没有找到相应抗噬菌体菌株的情况下,尽早发现噬菌体污染并及时采取补救措施,是减小经济损失的必要手段。无论是研究细菌与噬菌体间的相互关系,揭示噬菌体介导的基因水平转移所导致的生物多样性等相关问题,还是研究噬菌体的工程改造和寻找新的抗噬菌体方法,都需要对噬菌体及其宿主菌的遗传背景有清楚的认识。由于噬菌体的基因组可小至数千、数万碱基或者碱基对,因此对噬菌体基因组的测序和改造都极具可操作性,对噬菌体功能基因组学研究也相对比较容易,一旦取得成功,其学术价值和应用价值都不可估量。本研究以从2KGA产生菌荧光假单胞菌A46异常发酵液中分离纯化得到的噬菌体KS461-2为对象,初步研究了该噬菌体对荧光假单胞菌A46的感染及防治策略,并对已完成全基因组测序的KS461-2展开了基因组学分析和某些基因功能研究。主要结果包括以下几方面:1.利用透射电镜观察了2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌A46感染噬菌体KS461-2后的菌体形态变化。随着噬菌体感染时间的延长,菌体形态变化差异显著。2.荧光假单胞菌A46耐噬菌体KS461-2的突变频率在2.5×10-6左右。3.噬菌体KS461-2在pH7.5-8.0的条件下容易吸附于宿主而增殖。4.高锰酸钾、硫酸铜、柠檬酸铵和草酸铵4种常用抗噬菌体药物中,草酸铵能够有效抑制该噬菌体的增殖而对宿主菌的生长无明显影响,最佳添加浓度为0.7%。5.用DNAStar软件包中Editseq软件对KS461-2基因组的一般特性进行分析。KS461-2基因组全长85229bp,碱基组成:%A=30.51,%G=21.07,%T=29.45,%C=18.97,%稀有碱基=0.00;%A+T=59.96,%C+G=40.04。6.利用ORF finder软件进行ORFs初步分析,综合利用针对一般微生物基因注释工具glimmer在线分析软件和softberry网站的Gene Finding in Viral Genomes功能确定出163个推定基因,对KS461-2基因组中ORFs进行逐个BLASTx同源检索分析,得到44个已知功能的基因。7.在法国Pasteur实验室网站上对KS461-2基因组进行tRNA分析,预测出2个tRNA,并利用DNA Master模拟出其二级结构。8.在EMBL-EBI网站上利用CpG islands功能和softberry网站上的CpGFinder功能,分析得到噬菌体基因组上含有7个大于200bp的GC岛。其中,GC含量偏离最大的两个基因,即ORF99和ORF100可能是水平转移而来的外源基因。9.利用softberry网站opreon and gene finding in bacteria栏中的BPROM(promoterfinding in bacteria)功能,预测出噬菌体基因组上101个可能的启动子。10.利用法国巴斯德网站的PALINDROME软件分析基因组,得到15个反向重复序列;EQUICKTANDEM软件分析未发现基因组上有串联重复序列。11.经softberry网站上的FindTerm软件分析,在基因组上共找到了24个可能的不依赖p-因子的转录终止子12.选择9个同源蛋白种类较多的功能基因,利用DNAStar软件包中的MegAlign软件,分别将它们与各自的同源蛋白进行了多重对比,并绘出系统发生树。13.对溶菌酶基因和穿孔素基因表达产物进行了跨膜结构预测,结果显示,溶菌酶含有1个跨膜区域,穿孔素含有7个跨膜区域。
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