香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)是全球最重要香料物质之一,广泛应用于食品、医药、烟草、日化、电镀等多个行业。香草醛全球年需求量在15,000 t左右,制备方法主要有3种:化学合成法、植物提取法、生物技术法。目前市场上的香草醛大部分来自于化学合成,化学合成法原料来源广泛、工艺成熟,但是产物不专一且对环境污染严重。植物提取法获得的香草醛安全健康、香味纯正,但是产量受限。生物技术法主要包括酶法和微生物转化法,具有反应条件温和、周期短、成本低等优点。而且,国外(例如欧洲)的立法机构规定,使用生物活细胞或者其中的组成部分(例如酶)等生物资源产生得到的物质均属于天然产物。可见,生物技术法合成香草醛具有极大的发展潜力和市场前景。本文拟用酶法和微生物法实现异丁香酚转化成香草醛的反应。微生物法以纺锤芽孢杆菌CGMCC1347作为催化剂,探究天然低共熔溶剂(Natural Deep Eutectic Solvents,简称NADES)对全细胞催化合成香草醛的影响。酶法则以粗提的大豆脂肪氧合酶作为催化剂,探究各种反应条件(如酶量、底物浓度、反应时间温度、pH)和各种添加剂(如有机溶剂、表面活性剂、低共熔溶剂、天然低共熔溶剂、变性剂、螯合剂)对酶法合成香草醛的影响。主要研究内容如下:1、NADES对微生物法合成香草醛的影响选取13种NADES为添加剂加入到微生物法合成香草醛体系中,研究其对香草醛产率是否有促进作用,同时研究了NADES对非酶催化制备香草醛的影响。大部分NADES对微生物法合成香草醛及非酶催化合成香草醛均有促进作用,在非酶催化体系中,NADES促进程度相对较大,但香草醛浓度水平相对较低。采用了三种实验手段研究加入NADES对细菌细胞的通透性和细胞存活率的影响:(1)分光光度法,(2)激光共聚焦扫描显微术,(3)流式细胞术。实验结果显示,NADES对实验菌株确实存在一定的毒性作用,具体表现为造成细菌内核酸和蛋白的外溢、细菌细胞膜完整性受损,这在一定程度上解释了NADES对微生物法合成香草醛的促进作用。2、酶法合成香草醛反应体系的研究以大豆脂肪氧合酶为催化剂,异丁香酚为底物,硼酸缓冲液(pH 9.0、0.2 M)为反应介质,测试了反应温度、pH、底物浓度、酶量和反应时间等反应条件对生成香草醛的产率的影响。最优条件确定为:5 ml硼酸缓冲液(pH 9.0、0.2 M)、底物浓度30 g/L、酶量0.8 g、反应温度28℃,反应时间84 h。在最佳反应条件下,香草醛产率最高达2.68 g/L。在反应条件确定了的基础上,进一步研究了在反应体系中加入各种添加剂对香草醛产率的影响。这些添加剂包括:5种表面活性剂、10种有机溶剂、8种低共熔溶剂(DES)、13种天然低共熔溶剂(NADES)、7种羧酸类金属螯合剂、3种变性剂。实验表明,这些添加剂大部分对反应没有促进作用,但,其中,螯合剂的促进作用非常明显,特别是氨基羧酸类和羟氨基羧酸类的金属离子螯合剂,使得香草醛的产率得到显著提升,最高达对照组的405%。本文首次将螯合剂引入到酶法合成香草醛体系中,并发现其对香草醛产率有显著提升,很有可能跟酶的活性中心结构和催化机理有关。这为酶法合成香草醛提供了一种新思路。综上所述,酶法催化和全细胞催化都可以用于异丁香酚向香草醛的转化,加入适当的螯合剂对酶法合成反应有很大的促进作用。