糖尿病（Diabetes mellitus）是以高血糖为主要特征的内分泌代谢性疾病,受遗传因素和环境因素影响。已经成为继心脑血管疾病、肿瘤疾病之后第三类严重危害人类健康的慢性非传染性疾病。近年来患病人数不断攀升,中国发病人数已经高居世界第一,数量高达1.14亿。而且各个国家糖尿病患者数量都呈日益增多的趋势,预计到2035年全球糖尿病患者将达到5.92亿人。PDX-1基因即胰腺十二指肠同源框1,一种在胰腺发育中起关键作用的特异性转录因子,影响胰腺的早期发育及晚期的分化,导致糖尿病的发生与发展。随着基因编辑技术的不断发展,基因编辑技术已广泛应用于小鼠、大鼠、兔子,猪和绵羊等不同物种,但都不能完全复制人类疾病,非人类灵长类动物与人类高度相似（97%）,因此非人类灵长类动物有潜力作为潜在的人类疾病模型。利用非人灵长类动物能更好的模拟疾病的发病机制和病理过程。CRISPR/Cas9技术因其简单,方便和高效的编辑效率得到广泛的应用。本实验就是通过应用CRISPR/Cas9技术研制PDX-1基因敲除猴,为研究糖尿病发病的分子机制提供依据。具体的实验设计,研究内容和结果如下。本实验根据NCBI上食蟹猴的PDX-1基因序列,针对第一外显子和第二外显子设计出8条sgRNA。在体外验证设计靶位点的活性。每次按比例混合1～3条sgRNA与Cas9,通过显微注射到食蟹猴胚胎胞质中,体外培养5～7天收回胚胎,在胚胎上检验活性。共收回27枚胚胎检测其中21枚发育到2细胞以上胚胎并做TA单克隆测序。随后运用内窥镜微创手术进行胚胎移植。移植两周后做B超筛查怀孕猴,怀孕3月左右对羊水较充裕身体状况较好的其中一只母猴进行腹部穿刺,抽取羊水做鉴定。解剖观察流产猴胰腺组织并用甲醛固定猴组织,分离组织后储存在-80℃。剪取小猴耳朵,提取皮肤DNA做测序,并进行TA单克隆测序。通过HE染色对胰腺组织鉴定。结果发现有6条sgRNA有活性,第一外显子上的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA4、sgRNA5,第二外显子上的sgRNA6、sgRNA7体外检测均具有切割活性。在食蟹猴早期胚胎上sgRNA1、sgRNA2、sgRNA4、sgRNA7有切割活性。经过胚胎移植有三只母猴怀孕,其中一只怀双胞胎,其余两只怀单胎。三只怀孕母猴其中一只117天流产（仔猴命名1010）,另一只168天自然生产,产后仔死亡（仔猴命名1126）。怀双胞胎母猴在159天剖腹产,双胎其中体质较弱一只存活4 h（仔猴命名123101）,另一只存活6 h（仔猴命名123102）。对小猴基因检测后与野生型小猴做对比,123101和123102小猴均发生纯合突变,1010和1126小猴发生杂合突变。从解剖来看1010和1126有明显胰腺组织,123101和123102未见胰腺组织。从个体上看PDX-1基因突变小猴体重轻于野生型小猴。1010与WT相比胰岛细胞未见明显差别,1126小猴胰腺与WT相比较难发现胰岛组织。综合以上的实验结果,本论文获得了具有较强活性的sgRNA,证明设计的靶位点可在食蟹猴PDX-1基因上发生敲除。PDX-1第一外显子sgRNA1、sgRNA2、sgRNA4敲除的效果好于第二外显子sgRNA7,运用espcas9敲除效果好于spcas9。移植sgRNA1、sgRNA2共同注射的胚胎,得到有两只杂合敲除小猴和双胞胎纯合敲除小猴。本论文建立了相应的技术体系,建立了PDX-1基因敲除食蟹猴,为建立糖尿病动物模型提供了思路和参考。为早日得到糖尿病模型食蟹猴踏出了第一步。