研究目的ε毒素（ETX）在B型和D型产气荚膜梭菌致病过程中起着关键作用,对我国及世界其他地区畜牧业造成严重危害。另外,由于其高毒性的特点,ETX还是一种潜在的生物恐怖剂。然而,其致病机制尚未完全阐明。因此,深入探究ETX在体内的累积和毒性效应,并进一步利用细胞模型研究其致毒的分子机制,有利于阐明ETX致病的关键机理及发现新的治疗靶点。为预防和治疗B型和D型产气荚膜梭菌感染和我国的生物安全防护提供理论基础。研究方法1. 为了观察ETX是否对多个器官组织有损伤,我们构建His-ETX和m Scarlet-ETX质粒,纯化融合蛋白。m Scarlet-ETX经小鼠的尾静脉注射到小鼠体内,通过小动物活体成像观察m Scarlet-ETX在小鼠体内器官的累积情况。His-ETX经尾静脉注射后,对小鼠脏器组织通过免疫组化观察His-ETX在小鼠不同的脏器和小肠肠段上结合情况;HE观察His-ETX对不同脏器的病理性损伤情况;免疫荧光验证m Scarlet-ETX在不同小肠肠段上结合情况。2. 为了探究ETX导致人红细胞溶血的分子机制,我们通过细胞膜红色染料PKH26对人红细胞进行染色,置于激光共聚焦扫描显微镜下观察ETX对人红细胞体积的影响。同时利用流式细胞术检测ETX作用红细胞后Ca²⁺内流、神经酰胺丰度、磷脂酰丝氨酸外翻以及活性氧等变化。随后我们通过免疫荧光、免疫印迹和流式细胞术验证人、大小鼠红细胞和HEL细胞中MAL表达的情况,接着使用慢病毒介导的RNA干扰技术干扰HEL细胞中MAL蛋白的表达,再通过PI入胞、MTS、免疫印迹和免疫荧光技术验证MAL蛋白是否参与ETX诱导的细胞毒性作用。最后通过GST pulldown验证人红细胞和HEL细胞中MAL蛋白在体外能否与ETX结合。3.为了探究ETX是否对皮肤组织及其相关细胞有毒性作用,我们通过MTS、m Scarlet-ETX的结合、ATP释放、寡聚物和孔的形成实验来验证ETX对Ha Ca T和HEKs细胞的毒性作用。通过慢病毒介导的RNA干扰技术干扰Ha Ca T和HEKs细胞中MAL蛋白的表达,经MTS和免疫荧光技术验证MAL蛋白是否参与ETX诱导的细胞毒性作用。将不同浓度的His-ETX经皮下注射小鼠体内,统计ETX导致小鼠死亡的半数致死量。病理切片技术分析ETX在皮下的扩散情况以及其对皮肤、脑和肾组织病理性改变的情况,皮肤组织中m Scarlet-ETX的结合和MAL蛋白表达的情况。研究结果1.ETX能导致多个器官组织整体性损伤且其主要结合到小肠中的结肠部位。小动物活体成像整体观察发现与对照组相比m Scarlet-ETX主要积累于小鼠的脑部,随后取出不同的脏器分别置于小动物活体成像仪中观察发现m Scarlet-ETX组中的脑、肾、肺、肝、脾和心脏中荧光信号的强度明显高于对照组。His-ETX免疫组化的结果显示:对照组的脑、肾、肺、肝、脾和心脏组织中未发现阳性表达;ETX处理组中发现肾脏组织中的肾小管和肾小体上、脑组织中的白质部分、肺组织的肺泡周围、肝脏的肝小叶周围、脾脏的实质中以及心脏的心机膜中都有ETX的结合。HE结果表明,与对照组中相对应的正常组织相比ETX对小鼠的不同脏器都有病理性损伤:肾组织的远端小管上皮细胞中出现致密核,并伴有出血;脑组织中出现水肿;肺组织中肺支气管周围明显扩张,渗出大量的浆液;肝脏中肝小叶出现坏死,在坏死区域附近观察到肝细胞变性;脾脏中脾细胞变性,并伴有出血;心脏有明显地水肿和出血。另外与对照组相比较发现His-ETX和m Scarlet-ETX主要结合在结肠部位,在直肠、空肠和回肠部位有少量的结合,而在十二指肠和盲肠中未发现结合。2. ETX能与人红细胞的MAL蛋白结合并触发PS暴露。结果显示ETX能导致人红细胞收缩随后发生肿胀直至破裂,流式细胞术检测结果显示ETX能导致人红细胞Ca²⁺内流、神经酰胺丰度增加和磷脂酰丝氨酸外翻,但是不会导致活性氧的产生。免疫荧光和免疫印迹结果显示人红细胞和HEL细胞中MAL蛋白的表达,但是在小鼠和大鼠的红细胞中没有MAL蛋白的表达,并且MAL蛋白在人红细胞和HEL细胞的细胞膜上表达且与m Scarlet-ETX的结合有共定位的现象。随后对HEL细胞进行MAL蛋白敲除,与正常的细胞相比发现,ETX对干扰MAL表达的HEL细胞的细胞毒性明显减弱,并且ETX的成孔能力及寡聚物形成都明显地下降,并且首次在体外证实了ETX能直接和MAL蛋白结合。3. ETX对皮肤组织及其相关细胞的有毒性作用。研究发现ETX能结合到Ha Ca T和HEKs细胞上且有明显地细胞毒性,ETX在这些细胞上能形成孔和寡聚物,并且能导致这些细胞释放ATP。荧光染色发现在Ha Ca T和HEKs细胞中发现m Scarlet-ETX结合在细胞膜,并与细胞膜中的MAL蛋白的表达有共定位的现象。随后对这些细胞进行MAL蛋白敲除,与正常的细胞相比发现,ETX对干扰MAL蛋白的细胞的细胞毒性以及成孔能力没有明显地影响。统计经皮下注射ETX导致小鼠死亡的LD₅₀为109 ng/kg,并且会导致皮肤组织中毛囊和肌肉层水肿以及ETX在皮下不会向四周扩散,而是直接浸入内脏导致脑和肾脏组织水肿及出血。免疫荧光显示在人和小鼠的皮肤中有m Scarlet-ETX的结合,并且与MAL蛋白表达有共定位现象。研究结论首先证实m Scarlet-ETX在小鼠的脑、肾、肺、肝、脾和心脏组织中都有积累,ETX在这些器官组织中有结合并会导致其明显地病理学改变,而在小肠中ETX主要结合到结肠上,表明了ETX会导致整体性组织器官损伤且ETX的吸收主要在结肠部位;其次发现ETX会导致人红细胞先收缩,随后发生肿胀直至破裂并且引起Ca²⁺内流、神经酰胺丰度增加和磷脂酰丝氨酸外翻,在人红细胞上m Scarlet-ETX的结合和MAL蛋白的表达有共定位,MAL蛋白参与HEL细胞的细胞毒性、成孔和寡聚物的形成以及ETX在体外能与人红细胞和HEL细胞中的MAL蛋白结合,推测MAL蛋白在ETX诱导溶血中起着重要作用;最后发现ETX会导致Ha Ca T和HEKs细胞死亡,ETX经皮下注射的LD₅₀为109 ng/kg且导致皮肤中毛囊和肌肉层水肿,ETX在皮肤组织上的结合可能与MAL蛋白表达有关,但是MAL蛋白不参与ETX对Ha Ca T和HEKs细胞的毒性作用。这些数据为预防和治疗携带ε毒素基因的产气荚膜梭菌感染提供理论依据。