冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)是人类健康的主要杀手。心脏病流行病学调查资料表明,随着生活方式的改变,我国的CHD患病率和死亡率呈逐年上升趋势,据世界卫生组织(WHO)估计：到2020年左右,我国会迎来冠心病的“流行”顶峰。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是冠心病发病的病理基础,人们从500年前埃及木乃伊的动脉中就已发现粥样硬化性病变。人类认识AS是一种疾病并对其发病机制进行相关研究已有100余年的历史。有关AS的发病机制学说数量众多,其中包括内皮损伤学说、脂质浸润学说、血栓源性学说、动脉平滑肌细胞增殖学说等。而自1999年Ross提出AS的炎症反应机制以来,AS的炎症反应机制也已经广泛被医学界认可。研究证实,炎症参与了AS形成及发展的各个阶段,直至最终的血栓并发症。而近年来,免疫因素在AS的发生发展中的作用正在被人们认识并引起重视,更有学者提出AS是一种自身免疫性疾病。在AS中,多种参与免疫细胞和炎症因子构成了错综复杂的相互协同、相互影响的网络,炎症和免疫共同影响着AS的进程。T淋巴细胞是重要的免疫细胞,参与特异性免疫反应,它与AS的关系国际上已有不少研究。AS的病理改变特点为平滑肌细胞增殖、脂质沉积、巨噬细胞和淋巴细胞浸润、泡沫细胞形成。在人类AS的各个时期都有不同程度的淋巴细胞浸润,其中以T细胞为主。活动性斑块与稳定性斑块比较,T细胞显著增加。许多关于人类和啮齿目动物的研究证实,T淋巴细胞促进粥样硬化斑块的炎症反应,影响损害的进展及重塑。主要表现在以下几点：1.T细胞与斑块中其他免疫细胞及分子相互作用,促进粥样硬化；2.T细胞参与ox-LDL抗体、Hsp抗体等与AS相关的自身抗体形成；3.杀伤性T细胞溶解破坏巨噬细胞,释放大量促粥样硬化物质；4.T细胞在不稳定性斑块形成及斑块破裂中可能起一定作用。T细胞活化是其发挥病理生理作用的前提。而T淋巴细胞的活化需要两个信号,第一个信号是T淋巴细胞表面的TCR-CD3复合物同抗原递呈细胞(APC)上的MHC-Ⅱ类抗原肽复合物结合,赋予免疫应答的特异性,但不引起T细胞增生和分泌细胞因子；第二个信号是抗原非特异性的共刺激信号,由T细胞上的共刺激分子与APC表面的配体结合所诱导,启动维持并调节活化级联反应,决定了T细胞是活化增殖,或者转变为无反应状态甚至凋亡。重要的共刺激分子及其配基有：B7/CD28,血管细胞黏附分子(VCAM)-1/迟现抗原(VLA)-4,细胞间黏附分子(ICAM)-1/淋巴细胞功能相关抗原(LFA)-1, LFA-3/CD2, CD40/CD40配基,CD70/CD27等。近年来,一些新的共刺激分子陆续被发现,它们似乎在调节已活化的T细胞反应中有独特的重要性。负性共刺激分子PD-1 (Programmed death-1)和其配体PD-L (Programmed death-1 ligand)相互作用提供淋巴细胞活化的抑制信号,和正性共刺激信号形成了一个复杂的信号网络,综合调节免疫反应,在免疫活化和耐受中起关键作用。PD-1分子是免疫球蛋白超家族激活诱导的抑制性受体,是拥有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)的Ⅰ型跨膜蛋白,可诱导性表达于活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞、B细胞、NK细胞及骨髓细胞。PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)是PD-1的两个配体,PD-L1主要表达在树突状细胞、单核/巨噬细胞、B细胞、激活的T细胞,在内皮细胞、肿瘤细胞上也有表达,IFN-α、β、γ可上调其表达。PD-L2在树突状细胞、单核细胞上表达,IL-4、GM-CSF在体外强力诱导树突细胞上PD-L2的表达。PD-1-PD-L结合后,发挥对效应T细胞的负性调控作用,可抑制T细胞增殖和产生细胞因子IL-10、IFN-γ等。在免疫反应的起始部位和效应部位双重抑制免疫反应,防止过度的免疫损伤和自身免疫性疾病的发生,有利于维持机体的免疫自稳。PD-1负性共刺激信号的缺失会导致多种自身免疫性病变。动物实验显示,PD-1信号缺失导致小鼠发生类风湿关节炎及狼疮样自身免疫性肾炎,导致NOD小鼠自身免疫性糖尿病的快速进展。增加PD-1负性共刺激信号可使AS兔粥样斑块中T细胞浸润减少及炎性反应减轻,减轻实验性脑脊髓膜炎(EAE)程度,使脊髓浸润的巨噬细胞、CD4+、CD8+T细胞消失。近年来研究者们对PD-1在临床疾病的表达的研究发现,病毒感染(如HBV、HIV)、寄生虫感染、移植免疫、自身免疫病(如系统性红斑狼疮、系统性硬化)、肿瘤等多种疾病,都存在PD-1及其配体PD-L的表达异常,显示出PD-1信号在对维持外周耐受及免疫自稳方面起到保护性作用。他汀作为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,是有效的降脂药物。除调脂作用之外,他汀还具有包括改善内皮功能、增加NO生物利用率、抗氧化、稳定斑块、调节祖细胞、抗炎、免疫调节等多重血管保护作用。其抗炎及免疫调节方面的功效已在多种疾病如类风湿关节炎、多发性硬化的应用中体现。AS是一个慢性炎症反应,且具有自身免疫的特点,而PD-1在其中的作用机理尚不清楚。本研究通过对免疫负性调控信号分子PD-1在CHD患者外周血T淋巴细胞(PBTC)的表达情况的检测,初步分析了其在AS发病及进展中的意义；利用特异性PD-1阻断抗体研究其对AS患者PBTC的免疫学调节作用,进一步推测PD-1在AS中的调控机制；并通过观察辛伐他汀(Sim)对PD-1在CHD患者PBTC上的表达的调节作用,为PD-1作为AS免疫学治疗提供新的理论依据。第一部分：CHD患者PBTC上PD-1的表达目的：研究PD-1在CHD患者PBTC上的表达,初步探讨其在AS发生发展中的意义。方法：选择CHD患者(55例)为研究对象,其中稳定性心绞痛(SA)患者27例,急性冠脉综合征(ACS)患者28例,30例经冠脉造影证实的非CHD患者为正常对照组,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),分别用免疫荧光、流式细胞术及RT-PCR检测PD-1蛋白及mRNA在T淋巴细胞上的表达情况。结果：1.直接免疫荧光观察PD-1蛋白表达于PBTC的表面。2.流式细胞术检测PD-1蛋白表达PD-1在PBTC上的表达在SA患者组表达率为(9.29±2.34)%,ACS患者组为(8.19±2.36)%,正常对照组为(18.52±3.28)%。两组CHD患者的PD-1表达率低于正常对照组,差异具有显著性P<0.001)。3.RT-PCR检测]PD-1mRNA在PBTC的表达PD-1mRNA结果显示SA组患者表达量为0.552±0.079,ACS组为0.477±0.081,均低于正常对照组的0.928±0.057(P<0.001)。结论：PD-1在CHD患者PBTC上的表达明显降低,这可能在AS的发生及发展中起到作用。第二部分PD-1对体外培养CHD患者PBTC的免疫学调控作用目的：研究PD-1对体外培养CHD患者PBTC的免疫学调控作用。方法：PBTC分离与纯化同前。7例CHD患者和正常对照来自前一实验样本人群。正常人及CHD患者的PBTC新鲜分离纯化后,各分为4组,与另一健康人来源的成熟树突状细胞(mDC)以20：1比例混合,置于37℃的CO2培养箱共培养,72小时后收集各组上清液ELISA法检测IFN-γ、IL-4。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率反映T淋巴细胞的DNA合成。实验分组：1)PBTC组：PBTC加等体积的PBS作为阴性对照组；2)PBTC+mDC组：PBTC与mDC共培养；3)PBTC+mDC+PD-1Ig组：PBTC与mDC共培养体系中加入鼠抗人PD-1抗体(终浓度为10μg/ml)；4)PBTC+mDC+Ig组：PBTC与mDC共培养体系中加入鼠抗人同型对照Ig(终浓度为10μg/ml)。结果：1.PD-1共刺激分子对CHD患者和正常人PBTC增殖作用的影响：正常对照及CHD患者不同处理组之间差异有显著性意义(P<0.001)。PBTC+mDC+PD-1Ig组3H-TdR掺入率较PBTC+mDC组增加有显著性意义(P<0.001),而加入同型对照抗体则无变化(P>0.05)。析因方差分析显示,CHD患者组PD-1阻断后,PBTC增殖程度低于对照组,即PD-1分子抑制T细胞增殖的作用减弱。2.PD-1共刺激分子对CHD患者和正常人PBTC分泌细胞因子作用的影响：正常对照及CHD患者PBTC组、PBTC+mDC组、PBTC+mDC+PD-1Ig组和PBTC+mDC+Ig组的IFN-γ、IL-4表达量组间差异具有显著性。LSD比较分析表明,PBTC+mDC组比PBTC组IFN-γ和IL-4分泌增加有显著性意义(均P<0.001)；在PBTC+mDC组加入PD-1-Ig后,IFN-γ和IL-4分泌均增加,有显著性意义(均P<0.001),而加入同型对照抗体则变化无显著性意义(P>0.05)。析因方差分析显示,CHD患者组PD-1阻断后,细胞因子产生增加程度低于对照组,即PD-1抑制T细胞因子产生的作用减弱。结论：CHD患者及正常人体内PD-1共刺激分子在抑制PBTC增殖与分泌IFN-γ和IL-4发挥着重要的作用。CHD患者较正常人比较这种抑制作用相对减弱。第三部分辛伐他汀对PD-1在CHD患者PBTC表达的调节作用目的：观察辛伐他汀(Sim)对PD-1在CHD患者PBTC表达的调节作用,初步探讨他汀药物的免疫学调节AS的新机制。方法：取12例CHD患者新鲜外周血15ml,密度梯度离心法得到PBMC,并分为3个组：取分离出的CHD患者PBMC,同一患者细胞再分为空白对照组与Sim组：分别加入等体积的PBS与Sim(终浓度分别为10-6mol/L和10-5mol/L)。24小时小时后收集细胞,洗涤并调整浓度为5×105/ml。流式细胞术检测PD-1在PBTC的表达。结果：流式细胞术检测PBTC上PD-1蛋白的表达CHD患者PBMC在Sim作用24小时后,PBTC上PD-1的表达上调,10-5 mol/L Sim组较对照组及10-6 mol/LSim组诱导PD-1表达是上调明显,差异有显著性(P<0.001)。结论：他汀具有上调PD-1在CHD患者PBTC表达的作用,这一作用可能参与了其对CHD的免疫学调控机制。