研究背景和目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是目前消化道最常见的恶性肿瘤之一。迄今为止,公认的结直肠癌发病机制为“腺瘤—癌”顺序模式。对结直肠癌及其癌前病变的早期发现、早期诊断和鉴别诊断能够显著提高患者的生存率。炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组病因尚未完全清楚肠道免疫系统调节紊乱的非特异性慢性肠道炎症性疾病。虽然其发展成为结直肠癌的概率比较低,但炎症性肠病癌变长期以来却被认为是其最严重的并发症。对疾病的早期评估和干预是成功的预防策略之一,能够显著改善患者的预后。迄今为止,内镜检查和活检诊断仍是许多下消化道疾病包括结直肠瘤变和炎症性肠病的诊断金标准。共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy,CLE)的研发为下消化道疾病的早期诊断提供了强有力的技术支持。共聚焦显微内镜是一种新的显微内镜成像技术,可使图像放大1000倍,实现了在体内实时显示胃肠道组织、细胞和亚细胞结构,能够准确鉴别正常、增生或瘤变的黏膜,被誉为“光学活检”,使在体研究胃肠道生理、病理分子机制成为可能。近年来,共聚焦显微内镜分子成像及功能成像方面的研究正逐渐成为研究热点。分子成像能够检测肿瘤细胞的特征性分子表达,显微内镜分子成像实现了分子成像从体外至体内的重大突破,它结合了分子探针和显微内镜技术,实现在体实时检测肿瘤分子的表达水平。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是目前研究较为深入的肿瘤血管新生相关分子标记物。目前已经有利用共聚焦内镜在体对人结直肠癌动物菏瘤鼠肿瘤组织EGFR分子成像的相关报道,首次实现了结直肠癌的EGFR体内分子成像,该研究还证实了共聚焦激光显微内镜分子成像技术可体内实时鉴别不同类别种植瘤的EGFR表达水平差异。此外,作者还通过体外对人新鲜结直肠癌组织标本表面喷洒荧光标记的EGFR抗体探针的方式,利用FIVE1小型共聚焦探针行EGFR分子成像,结果表明共聚焦系统可检测肿瘤组织和非肿瘤组织的EGFR表达差异。该实验为EGFR分子成像由动物实验向人体应用过渡提供了理论依据。依据形态学和功能学诊断标准,显微内镜功能成像能够对细胞、组织的病理生理动态过程进行在体实时成像,如细胞脱落、细胞迁移、坏死和凋亡及组织的血流灌注及其改变。上皮细胞的不断更新(细胞脱落,gaps)是一个可能导致胃肠道上皮屏障破坏的潜在因素。研究表明在炎症环境下,上皮增生更新加快,上皮屏障功能破坏的危险性则变得复杂化。Kiesslich等人的研究显示,动物腹腔注射TNF-α诱导小肠炎症时有20%的gaps存在通透性改变。一项研究利用CLE观察IBD患者及对照组静脉注射荧光素钠后gaps的密度,发现IBD患者回肠末端黏膜上皮细胞gaps的密度明显高于正常对照组。还有研究显示,IBD患者回肠末端gaps密度升高能够预测疾病的复发。既往的研究发现,益生菌能够通过多种机制通过促进紧密连接蛋白成熟等多种方式保护紧密连接蛋白,继而降低肠道上皮通透性、维持肠道上皮的屏障功能；此外,研究证实,多种益生菌及其蛋白成分能有效的减少炎性因子诱导或坏死性小肠结肠炎的上皮细胞凋亡。因此,我们推测益生菌可能能够修复炎症性肠病回肠末端黏膜上皮细胞gaps。然而,迄今为止,尚无在体观察益生菌对肠道上皮gaps的影响及其机制的研究报道。本研究拟围绕共聚焦激光显微内镜在下消化道病变分子成像和功能成像中的应用展开研究,研究目的包括：1.评估共聚焦显微内镜在体对结直肠癌和腺瘤患者行EGFR分子成像的价值,并比较在体共聚焦显微内镜分子成像技术和体外活检组织免疫组化技术在评价EGFR表达水平上的价值；2.利用共聚焦显微内镜对炎症性肠病患者回肠末端上皮细胞脱落(gaps)行功能成像并检测其密度,探索益生菌对上皮gaps的修复作用及其可能的机制。研究方法：第一部分：共聚焦显微内镜对结直肠瘤变在体分子成像的研究自2011年1月至2011年6月,于我院就诊的40例已知结直肠瘤变的连续门诊或住院患者入组研究,所有的患者均依据术前的结肠镜检查安排了外科手术或内镜下切除手术。研究分为两个阶段：第一阶段,先期研究,为了探索合适的分子探针浓度和孵育时间,共聚焦显微结肠镜(Pentax EC-3870K)白光模式下,用喷洒管对3名已知结直肠癌的患者肿瘤组织表面喷洒5ml Alexa Fluor488绿色荧光标记的EGFR抗体探针(探针浓度分别为1：50,1：100和1：500),10min及15min后开启共聚焦显微内镜模式行分子成像,随后于分子成像部位行靶向活检。结果显示,分子探针浓度在1：50、孵育时间在10min时即可达到较好的分子成像质量。第二阶段,前瞻性研究,37例已知结直肠瘤变患者入组研究,充分冲洗组织表面后,在体对患者肿瘤组织或腺瘤组织表面喷洒1：50浓度的EGFR抗体探针,10min后利用共聚焦显微结肠镜行在体EGFR分子成像。此外,对10例结直肠瘤变患者,我们除对瘤变组织行分子成像外,同时对邻近的正常黏膜组织进行了EGFR在体分子成像。所有在体分子成像的部位均行靶向活检行体外EGFR免疫组织化学检查和HE病理检查。共聚焦在体分子成像的图像均予以事后分析,每位患者选取荧光强度最强的1张图片,选取该图片3个60*601μm荧光强度最强的感兴趣区域(region of interest, ROI),用ImageJ软件进行灰度值分析。名有经验的消化病理医师按维也纳分型对病理结果做出盲法诊断。此外,4名参与研究的患者于内镜结束后的4-6周后采取外周血检测血人抗小鼠抗体变化。第二部分：共聚焦显微内镜对炎症性肠病回肠gaps功能成像的研究研究分为两个步骤,分别为临床研究和动物研究。第一部分,临床研究,纳入已知或怀疑炎症性肠病来我院就诊的门诊患者,对照组为健康查体者及息肉切除术后复查患者。在充分的肠道准备后在静脉全麻下对所有入组患者行共聚焦显微结肠镜(Pentax EC-3870K)检查,所有患者在进镜至回肠末端,静脉注射6ml荧光素钠,开启共聚焦模式对至少5个白光模式下正常的黏膜部位上皮细胞gaps进行观察并采集图像。事后采用盲法对采集的图像进行分析,计数患者回肠末端gaps密度。第二部分,动物研究,动物模型分为TNBS造模IBD大鼠组、益生菌VSL#3治疗IBD大鼠组和正常对照大鼠组三组,利用小型动物活体共聚焦成像系统FIVE1(Optiscan公司)在体观察三组动物模型回肠末端上皮gaps密度(每1000个上皮细胞中gaps的数目),对大鼠回肠末端黏膜活检组织行免疫组化检测紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达量,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测黏膜炎症因子IL-1β表达,研究益生菌治疗对IBD大鼠回肠末端gaps的修复作用。此外,我们还对大鼠腹腔注射不同剂量的IL-1β后观察大鼠回肠末端上皮gaps密度的变化,探讨炎症因子IL-1β对上皮细胞gaps的影响。研究结果：第一部分：共聚焦显微内镜对结直肠瘤变在体分子成像的研究前瞻性研究共纳入37例结直肠瘤变患者(21例男性,16例女性),表面喷洒AF488标记EGFR抗体后利用共聚焦内镜行分子成像显示,18例结直肠癌(18/19,94.7%)和12例结直肠腺瘤(12/18,66.7%)可检测到EGFR特异性荧光信号。18例EGFR分子成像阳性的结直肠癌组织中包括8例高分化(8/8)、10例中分化(10/11)和0例低分化(0/0)。12例分子成像阳性的结直肠腺瘤组织中包括6例高级别上皮内瘤变(6/10)和6例低级别上皮内瘤变(6/8)。对共聚焦图像灰度值分析显示,结直肠癌EGFR分子成像平均灰度值为52.84±5.73,结直肠腺瘤为44.31±4.86(p=0.329)。而对正常结肠黏膜行EGFR分子成像显示,仅有3例呈弱阳性,其余7例均为阴性。10例正常黏膜分子成像的平均灰度值为36.23±7.90,对应的10例结直肠瘤变组织平均灰度值为53.78±7.06(p<0.001)。体外组织EGFR免疫组化和体内EGFR分子成像的一致性的Kappa值较高,为0.788。4-6周后采集的4例血清样本显示,所有样本HAMA滴度值均未有明显升高。第二部分：共聚焦显微内镜对炎症性肠病回肠gaps功能成像的研究共有43例患者入组临床研究,其中,19例溃疡性结肠炎患者,4例克罗恩病患者与20例正常对照患者。与正常对照组(1.50gaps/1000细胞)相比,IBD患者的回肠末端上皮细胞gaps密度显著增加(38.00gaps/1000细胞,p<0.001)。动物研究中,与正常对照组大鼠(14.17±4.17gaps/1000细胞)相比,IBD组大鼠回肠末端上皮gaps密度(47.83±7.57gaps/1000细胞)显著升高(p<0.001)。益生菌VSL#3治疗IBD组大鼠回肠末端gaps密度较IBD组大鼠显著降低(19.33±4.84gaps/1000细胞,p<0.001)。腹腔注射10或5μg/kg IL-1β后,大鼠回肠末端gaps密度均显著升高(205.00±23.48gaps/1000细胞和157.67±28.36gaps/1000细胞)。益生菌治疗IBD组大鼠回肠末端黏膜紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达升高,炎症因子IL-1β表达下降。研究结论：1.本研究首次证实了利用共聚焦显微内镜和荧光标记EGFR抗体分子探针可实现对结直肠瘤变患者的在EGFR分子成像。这种新型体内分子成像技术为结直肠癌的分子靶向治疗提供了理论依据。2.共聚焦内镜可以对细胞脱落gaps行在体功能成像,共聚焦内镜观察下,IBD患者回肠末端gaps密度显著升高,在体对IBD动物模型行功能成像表明,益生菌可能通过降低炎症因子表达,提高紧密连接蛋白表达的方式修复IBD动物模型回肠末端黏膜gaps。研究意义：本研究第一次利用共聚焦显微内镜,通过表面喷洒荧光标记EGFR抗体探针的方式实现了对结直肠瘤变患者在体EGFR分子成像。共聚焦显微内镜能够检测出靶向EGFR分子的特异性细胞荧光信号。对成像部位行体外EGFR免疫组化检测与在体EGFR分子成像一致性较高。通过计算共聚焦分子成像灰度值的方式能够区分结直肠瘤变和正常结直肠黏膜。EGFR显微内镜分子成像的实现,将有助于早期发现结直肠癌,并对其行分型诊断和指导分子靶向治疗。此外,共聚焦显微内镜能够对IBD患者回肠末端gaps行功能成像,研究还首次证实了益生菌能够通过降低炎症因子和提高紧密连接蛋白的表达等多种机制修复上皮细胞gaps,这可能是益生菌治疗IBD的机制之一。