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本研究采用双酶切定向克隆的方法，成功地将人乳铁蛋白表达序列与内部核糖体进入位点(IRES)连接起来，构建了重组载体pIL。通过BamH I单酶切连接构建了人溶菌酶和人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体pEBHIL。利用脂质体包裹pEBHIL导入奶牛乳腺上皮细胞，经G418筛选及PCR检测筛选获得阳性细胞，以之作为供体细胞利用核移植技术构建转基因克隆胚。通过PCR法检测转基因克隆胚中的外源基因，并观察绿色荧光蛋白表达，从而实现在转基因克隆胚早期发育过程中对外源基因的检测，为进一步移植阳性克隆胚，得到转基因动物个体奠定基础。研究结果如下：1.采用PCR法分别克隆了2255bp的人乳铁蛋白基因（hLTF）和986bp内部核糖体进入位点(IRES)序列，PCR产物回收纯化后，hLTF克隆在pMD18-T Vector的T位点，质粒标记为phLTF；IRES克隆在pGEM-T Easy Vector的T位点，质粒标记为pIRES。将质粒phLTF和质粒pIRES分别用Xba I/Nhe I双酶切，回收目的片段，T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆pIL。利用BamH I酶切质粒pIL和质粒pEBH(含人溶菌酶基因)，T4DNA连接酶连接，BamH I酶切鉴定连接方向，构建了乳腺特异性表达载体，标记为pEBHIL。此载体含有调控序列（奶牛β-酪蛋白5′和3′调控序列）、目的基因（人溶菌酶基因及人乳铁蛋白基因）、内部核糖体进入位点(IRES)、报告基因（绿色荧光蛋白基因）以及抗性基因（neo+基因）。2．采用脂质体包裹含人溶菌酶/乳铁蛋白的双基因表达载体pEBHIL，导入奶牛乳腺上皮细胞，在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，经G418筛选及PCR鉴定获得阳性细胞。转染细胞增殖后经激素诱导，Western Blot检测培养液上清液，证明转染细胞表达并分泌人溶菌酶和人乳铁蛋白，分子量分别是14.7ku和40ku。转基因细胞传代培养15代，对第3、5、7、9、11、13代细胞作染色体核型分析表明，离体条件下培养细胞未发生转化（2n=60）。从而为核移植技术制备转基因牛提供了细胞来源。3.本研究分别从MⅡ卵母细胞去核方法、供核细胞同期化处理、转基因与未转基因的乳腺上皮细胞、冻-融与未冷冻的转基因供核细胞以及转基因乳腺上皮细胞的传代次数等方面比较了克隆胚的构建效率。结果表明，DM辅助去核法较盲吸法更适合MⅡ卵母细胞的去核（19.5%vs11.0%，p<0.05）；接触抑制法诱导牛乳腺上皮细胞同期化的效率显著高于血清饥饿法（19.5%vs11.8%，p<0.05）；转基因与未转基因乳腺上皮细胞为核供体对克隆胚构建效率差异不显著（16.8%vs18.7%，p>0.05）；未冷冻的转基因牛乳腺上皮细胞作为供体细胞构建克隆胚效率显著高于冻-融组（16.8%vs9.2%，p<0.05）；以第3、5、7、9代阳性转基因乳腺上皮细胞为核供体构建克隆胚的效率差异均不显著（P>0.05）。4．PCR法检测表明，外源目的基因已整合到转基因克隆胚的染色体上；荧光显微镜下观察到转基因克隆胚中绿色荧光蛋白（GFP）表达，发现部分克隆胚在2-细胞时就开始表达GFP，但是表达量小，荧光弱，随着胚胎体外发育时间延长，细胞数增多，EGFP的表达也逐渐增强。说明外源基因在胚胎早期阶段可以表达，绿色荧光蛋白基因可以作为报告基因来实现对外源基因在早期胚胎整合及表达的检测。