研究背景随着电磁技术的蓬勃发展,微波在给人类社会带来益处的同时也成为危害人类生存环境的新型污染源,微波辐射对长期暴露人群身心健康的影响愈加凸显。大量调研发现,特殊作业环境人员或长期职业暴露人群会不同程度受到电磁超敏综合征的困扰,易出现头痛、恶心、胸痛、睡眠障碍和记忆障碍等相关症状,迫切地需要安全、有效的防护药物。根据微波辐射损伤效应,抑制机体氧化应激是当前微波辐射损伤防护药物的主要筛选策略和研究方向,尽管一些具有抗氧化活性的天然产物成为研究热点,但仍然缺乏具有应用前景的防护药物,其中微波辐射损伤机制不明确是制约其药物研究的瓶颈问题。因此,结合天然产物的作用特点阐明微波辐射损伤机制是微波辐射损伤防护药物研究亟待解决的现实科学问题。本课题组前期从发酵大豆中筛选得到了一个具有抗微波辐射活性的有效部位,经超临界CO2萃取技术制备得到的发酵大豆脂类部位（FSE-C）易得、有效且安全性良好,具有潜在的开发前景。研究目的本论文旨在系统地表征FSE-C的化学物质基础,阐明发酵前后脂类成分结构及含量的变化;优化FSE-C的制备工艺,改善其脂类组分配比以提高其生物活性;聚焦微波辐射致脑认知损伤生物效应,揭示FSE-C抗微波辐射致脑认知功能障碍的脂代谢调控作用和特征,进而探索其脂代谢调控机制,以期为微波辐射损伤防护药物的研究和筛选提供新技术和新策略。研究方法1.采用GC-FID法分析FSE-C和未发酵大豆脂类提取物（SE-C）的脂肪酸组成,采用HPLC-ELSD/APCI-MS法表征FSE-C和SE-C的化学成分,比较分析发酵引起的差异脂类成分变化。2.采用单因素实验结合响应面法优化FSE-C的超临界CO2制备工艺。针对最优制备工艺制得的FSE-C,开展了脂肪酸组成分析（GC-FID法）、酸值和皂化值测定（容量分析法）以及微量脂质伴随物分析（HPLC、GC和分光光度法）。3.建立S波段高功率微波辐照致大鼠脑认知功能障碍模型:（1）采用Morris水迷宫测试、苏木素伊红染色、脏器指数测定、血清生化分析和外周血细胞计数等实验方法,考察FSE-C对辐照大鼠空间学习和记忆功能、海马组织病理结构、脏器指数以及血生化血常规指标的影响,研究FSE-C抗微波辐射致脑认知功能障碍的作用。（2）利用UPLC-MS技术的脂代谢组学分析方法,分别分析微波辐照大鼠血清和海马组织脂类代谢物的代谢轮廓,寻找差异表达的脂类代谢物,考察FSE-C对辐照大鼠内源性差异脂类代谢物的影响,揭示FSE-C对辐照大鼠血清和海马组织的脂代谢调控作用及特征。4.构建Erastin体外诱导神经细胞损伤模型模拟体内脑认知功能障碍,采用比色分析、荧光染色、流式细胞术、荧光定量PCR、Western blotting和脂质组学等技术手段,研究FSE-C对神经细胞损伤的保护作用,考察FSE-C对脂代谢损伤效应、脂代谢相关基因或载体蛋白以及差异脂类代谢物的影响,为揭示FSE-C抗微波辐射致脑认知功能障碍的脂代谢调控机制奠定基础。研究结果1.FSE-C与SE-C相比,脂肪酸组成中棕榈酸和ɑ-亚麻酸的含量显著升高,油酸的含量显著降低。FSE-C中的这些脂肪酸主要以三种脂类组分形式存在,即游离脂肪酸组分（FFAs）、甘油二酯组分（DAGs）和甘油三酯组分（TAGs）,其中FFAs和DAGs含量较SE-C显著升高,TAGs含量显著降低,提示:FFAs和DAGs是重要的活性物质组分,作为大豆经发酵后产生的关键优势组分,可进一步指导FSE-C的制备工艺优化。2.FSE-C最优制备工艺条件为:萃取温度35℃、萃取压力30 Mpa、豆味噌水分含量不超过3.0%。（1）优化的工艺可制备得到质量稳定的FSE-C,其组分加权萃取量的实际值为6.93±0.11 g/100g（理论值:6.78 g/100g）,三种脂类组分FFAs、DAGs和TAGs的含量分别为75.73±2.46%、4.84±0.28%和16.77±2.54%。（2）工艺优化后FSE-C的不饱和脂肪酸占比约80.04%,饱和脂肪酸占比约14.39%;其酸值和皂化值分别为148.90±0.34 mg KOH/g和197.46±1.34 mg KOH/g;同时,测得FSE-C中的维生素E总含量为162.31±1.87 mg/100 g,植物甾醇总含量为654.89±20.09 mg/100 g,角鲨烯含量为13.81±0.16 mg/100 g,总黄酮和总多酚含量分别为9.85±0.90 mg/100 g和50.64±4.44 mg/100 g。3.FSE-C抗S波段高功率微波辐照致大鼠脑认知功能障碍的作用:（1）Morris水迷宫实验表明,FSE-C能够明显缩短辐照大鼠的平均逃避潜伏期,改善了微波辐射致大鼠在空间学习和记忆方面的脑认知功能障碍。（2）光镜观察辐照大鼠海马区域发现,FSE-C能够在一定程度上减轻微波辐射致大鼠海马组织结构的损伤。（3）脏器指数测定显示,FSE-C能够不同程度地改善辐照大鼠脾脏指数和胸腺指数的异常。（4）血清生化测试表明,FSE-C能够有效地调控辐照大鼠血清甘油三酯和高密度脂蛋白,促进其恢复至正常水平。（5）外周血细胞计数显示,FSE-C能够不同程度地促进辐照大鼠外周血白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞百分比、单核细胞百分比和血红蛋白的恢复。4.FSE-C抗S波段高功率微波辐照致大鼠脑认知功能障碍的脂代谢调控作用及特征:（1）照后7 d辐照大鼠血清非靶脂代谢组学分析表明:SH组和MW组血清样本中分析鉴定了68个差异表达的脂类代谢物,主要包括磷脂酰胆碱类、溶血磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类、溶血磷脂酰乙醇胺类、甘油三酯类和游离脂肪酸类,表明微波辐射能够引起机体脂代谢紊乱,重要的代谢通路涉及亚油酸代谢通路、甘油磷脂代谢通路和甘油酯代谢通路等。FSE-C可改善血清样本中43个差异脂类代谢物的表达,有效地下调了大量差异表达的甘油三酯类代谢物,与降低辐照大鼠血生化甘油三酯水平的疗效一致;FSE-C对血清缩醛型磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺（PE 20:4/18:0）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE 0:0/18:0）的改善可能有利于减轻微波辐射导致的脑认知功能障碍。（2）照后14 d的辐照大鼠海马脂质组学分析表明:SH组和MW组海马组织中分析发现了30个差异表达的脂类代谢物,包括二十六碳酸、2个磷脂酰胆碱类、11个鞘磷脂类和16个甘油三酯类。FSE-C可改善辐照大鼠海马组织中二十六碳酸、烷氧型磷脂酰胆碱（PC O-18:0/20:3）、4个鞘磷脂类和11个甘油三酯类代谢物的差异表达,从而减轻微波辐射致脑认知功能障碍。5.FSE-C抗Erastin诱导神经细胞损伤的脂代谢调控机制:（1）FSE-C对正常生长的PC12细胞无抑制作用。然而,FSE-C中三种脂类组分对细胞的生长均显示出不同程度的抑制作用。（2）FSE-C及其FFAs和DAGs能够明显提高Erastin诱导铁死亡细胞的存活率,具有良好的铁死亡抑制作用。（3）FSE-C可明显降低细胞内Fe2+水平,抑制细胞内脂质过氧化物和ROS的产生,提高细胞内GSH含量,从而减轻Erastin诱导神经细胞铁死亡过程中脂代谢相关的损伤效应。（4）FSE-C可明显上调细胞GPx4 m RNA和SLC7A11 m RNA的表达,并且呈剂量依赖地下调细胞ACSL4 m RNA和LPCAT3 m RNA的表达。此外,FSE-C还可显著升高GPx4的蛋白表达量,表明FSE-C对铁死亡的特征性差异表达基因具有良好的调控作用,其对GPx4和SLC7A11的激活有助于促进GSH的生物合成,对ACSL4和LPCAT3的抑制有助于减轻细胞的脂质过氧化反应,改善Erastin诱导的神经细胞损伤。（5）FSE-C可有效地调节细胞内80个差异表达的脂类代谢物（包括6个游离脂肪酸、30个磷脂酰胆碱、5个磷脂酰乙醇胺、34个甘油三酯和5个鞘磷脂）,特别是明显改善多不饱和脂肪酸和含多不饱和脂肪酸侧链磷脂的差异表达。由此可见,FSE-C抑制细胞铁死亡的作用机制与其对细胞脂代谢的调控作用密切相关。研究结论1.本研究系统地对FSE-C进行了制备工艺优化和化学成分表征。FSE-C是一类由FFAs、DAGs、TAGs和微量脂质伴随物构成的多组分脂类有效部位,能够通过优化的超临界CO2萃取工艺稳定制备。2.FSE-C可明显减轻S波段高功率微波辐照致大鼠脑认知功能障碍,降低辐照大鼠的平均逃避潜伏期,改善海马组织结构的损伤和血清脂代谢指标的异常。3.本研究率先发现并证明了S波段高功率微波辐照可致大鼠血清脂代谢紊乱,脂质代谢调控有望为微波辐射损伤机制提供新的研究方向。FSE-C能够有效地调控辐照大鼠血清样本中差异表达的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等脂类代谢物,其中差异表达的缩醛型磷脂酰胆碱和花生四烯酸取代的磷脂酰乙醇胺可作为微波辐照致大鼠脑认知功能障碍的潜在生物标志物,为微波辐射损伤防护药物的筛选提供新策略。4.为探索微波辐照致脑认知功能障碍与脂质代谢之间的联系,分析了辐照大鼠海马组织的脂代谢特征,FSE-C不仅能够有效地调控海马组织中甘油三酯类差异代谢物,而且还可促进血清甘油三酯水平的恢复。由此可见,甘油三酯类代谢物可作为微波辐照致大鼠脑认知功能障碍的生物标志物,为微波辐射损伤防护药物的筛选提供新的作用靶标。5.FSE-C可明显抑制Erastin致神经细胞铁死亡,提高铁死亡细胞的存活率,减轻铁死亡细胞内的脂代谢损伤效应(Fe2+、脂质过氧化物、ROS、GSH),调控并促进脂代谢相关基因或载体蛋白（GPx4、SLC7A11、ACSL4、LPCAT3）以及差异脂类代谢物（多不饱和脂肪酸和含多不饱和脂肪酸侧链的磷脂）的恢复。以上研究结果可为进一步揭示FSE-C抗微波辐射致脑认知功能障碍的脂代谢调控机制提供关键的研究思路和可靠的数据支撑。