几丁质是真菌细胞壁的重要成分之一,具真菌特异性,由几丁质合酶(chitin synthase,CS)催化合成。真菌中存在7类CS,不同真菌的CS同功酶种类各不相同。酵母类仅有Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ类CS,其中Ⅱ和Ⅳ类具重要的生物学功能。丝状真菌往往有7类CS,其中Ⅲ,Ⅴ,Ⅵ类具重要的生物学功能。研究真菌抑制剂对于真菌病害防治有重要意义。本研究以酿酒酵母YFK32为指示菌株,通过96孔板法筛选到若干具有抑制酵母作用的微生物菌株,用滤纸片法发现了若干中药提取物具有明显的抑制酵母生长作用。Calcofluor white(荧光增白剂)能抑制酿酒酵母的生长,而这种生长抑制能被CS抑制剂解除的机理,本研究用YFK32为指示菌株,以CS作为筛选靶标,在平板中加入具抑制浓度的calcofluor white,然后观察平板中加样点附近酵母生长圈进行正筛选。通过该方法得到了若干个可能是CS抑制剂的中药提取物。由于不同抑制剂针对不同的CS同功酶,仅含有一个CS基因的缺陷型酵母比野生型酵母对靶标抑制剂更加敏感。为更精确了解筛选获得的抑制剂的作用机理,我们通过敲除chs1和chs3,构建了仅含有CS2的缺陷型酵母。但是通过检测发现这些中药提取物不是CS2的特异性抑制剂。这些中药提取物的抑制作用仍需进一步研究。此外,为更好了解丝状真菌的CS功能。本研究通过PCR扩增灰霉chs V基因上、下游各1.5kb和1.3kb的同源序列,并利用合适的内切酶将同源序列构建至pAG32质粒的潮霉素抗性基因(HygB)两侧,形成基因敲除构件(Gene Disruption Cassette)。为提高基因敲除效率,本研究将基因敲除构件亚克隆至双元载体中,并将之转化农杆菌,通过农杆菌介导法对灰霉基因进行敲除。