论文部分内容阅读
蚜虫隶属于昆虫纲(Insecta)半翅目(Hemiptera),繁殖速度快,广泛分布于世界各地,主要通过刺吸植物韧皮部汁液为生。前人研究中发现麦长管蚜Sitobion avenae孤雌蚜有翅和无翅个体中存在很多差异表达的微小RNA(microRNA,miRNA)。为进一步研究这些miRNA在蚜虫翅型分化中的调控机制,本研究以豌豆蚜Acyrthosiphon pisum为研究对象,选择在麦长管蚜中差异表达显著,且靶基因为蜕皮激素、胰岛素信号通路及翅型发育关键基因的5个miRNA(Let-7、miR-92a、miR-92b、miR-92a-1-p5和miR-277),使用miRanda和RNAhybrid软件在豌豆蚜中预测其靶基因。同时,利用qPCR检测这些miRNA及其靶标基因在豌豆蚜3~4龄幼蚜和成虫有翅和无翅个体中的表达谱。然后在外源HEK293细胞系中,通过双荧光素酶活性检测法上述miRNA的靶基因进行验证。最后用蜕皮激素(20E)处理豌豆蚜2龄幼蚜,检测5个miRNA及其靶标基因在处理后表达量的变化,探索蜕皮激素如何通过miRNA调控蚜虫翅型分化。主要研究结果如下:1.miRNA靶标基因预测结果。通过生物信息学,利用miRanda和RNAhybrid软件进行预测,分析豌豆蚜相关miRNA与靶基因互作图,结果表明Let-7和PC-3p-94006-17与abrupt的3’UTR匹配较好;miR-9a与flightin的5’UTR匹配较好;miR-92a与wingless的CDS区匹配较好;miR-92b和miR-996-p5与Foxo的CDS区匹配较好;miR-277与Uba1的5’UTR区匹配较好;miR-92a-1-p5与flightin的CDS区和ultraspiracle(Usp)的CDS区匹配较好;miR-3020-p3与Usp的3’UTR匹配较好,表明这些基因可能为miRNA的靶基因。2.miRNA与靶标基因在豌豆蚜不同发育阶段的表达谱。以豌豆蚜不同发育阶段的RNA为研究对象,利用实时荧光定量PCR法检测这些miRNA与靶标基因在不同发育阶段的表达谱。表达谱分析发现,5个miRNA在豌豆蚜成虫中的表达量均高于其在幼虫期的表达量。而预测的靶基因在4龄幼虫中的表达量均高于在成虫中的表达量,与miRNA表达趋势相反,表明miRNA对其靶基因的抑制作用可能发生在成虫阶段。分析豌豆蚜有翅和无翅个体中5个miRNA的表达情况发现,在成虫有翅个体中5个miRNA的表达量均高于无翅个体中的,其中miR-277差异最显著,成虫有翅个体的表达量是无翅个体的7.5倍,其次为Let-7,达3倍。miR-92a-1-p5,其在成虫有翅个体中的表达量是无翅个体的1.6倍。而Let-7在3龄有翅蚜和无翅蚜中差别最显著,有翅个体的表达量是无翅个体的37.8倍,其次为miR-277,达7.6倍。比较5个miRNA与其靶基因在两个龄期有翅和无翅个体中的表达谱发现,Let-7和miR-92b的表达趋势分别与其靶基因abrupt和Foxo的基本相反。miR-92a-1-p5预测的靶基因flightin在豌豆蚜3龄、4龄幼蚜和成虫有翅个体中表达量均显著高于无翅个体。靶基因Uba1和wingless在豌豆蚜3龄无翅个体中表达量均显著高于有翅个体,与miR-92a和miR-277在该龄期的表达趋势相反。3.miRNA靶基因验证。成功构建flightin-CDS的过表达载体pmirGLO-flightin-CDS和abrupt 3’UTR的过表达载体pmirGLO-abrupt 3’UTR。在外源HEK293细胞系中,利用双荧光素酶报告实验检测miRNA与其靶标的互作关系。结果表明,共转染pmirGlO-abrupt 3’UTR过表达载体与Let-7模拟物,细胞荧光素酶活性与共转入pmirGlO-abrupt 3’UTR过表达载体和阴性对照相比显著降低,下降48%,达极显著水平共。表明Let-7的真实靶标为abrupt。共转染pmirGLO-flightin-CDS过表达载体和miR-92a-1-p5模拟物后与共转染pmirGLO-flightin-CDS和阴性对照相比,荧光素酶活性下降40%,达极显著水平。表明miR-92a-1-p5的真实靶标为flightin。其他miRNA与靶基因的互作结果不显著。4.蜕皮激素对miRNA及其靶标基因表达的影响。以蜕皮激素处理2龄幼蚜的RNA为研究对象,利用实时荧光定量PCR法检测miRNA与靶标基因在蜕皮激素处理后的表达谱。结果表明,5个miRNA的表达量都在20E处理30 min后出现了不同程度的上调,其中变化最显著的是Let-7,在处理10 min后上调了54%,30 min后上调了1.94倍。其次是miR-92a-1-p5在20E处理30 min后上调了1.14倍。5个miRNA的靶基因的表达量在20E处理10 min后均出现了不同程度的下调。其中flightin的表达量出现了明显的下调,在20E处理10 min后下调了37%,30 min后下调了39%。abrupt的表达量也出现了明显的下调,20E处理10 min时下调了33%。表明20E可能会抑制靶基因的表达。20E处理后,miR-92a-1-p5表达量上升,导致靶基因flightin表达量下调,预测靶基因flightin可能在豌豆蚜翅型发育中起重要作用,豌豆蚜有翅的比例也可能会下降。本研究明确这些miRNA在豌豆蚜中发挥作用的发育阶段,初步探索miRNA调控孤雌蚜翅两型性分化的机制,为进一步探索miRNA参与孤雌蚜翅两型性分化的机制奠定良好基础。