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酶工程技术在食品、医药及化工等领域起着越来越重要的作用,但工业用酶在实际应用过程中常会因其处在极端环境下而失活,从而极大地限制了其推广和应用。因此,对酶分子的稳定性改造是当前研究的热点和难点。而鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)是一种稳定较高的胰蛋白酶类蛋白酶,因此,阐明该酶的稳定性分子机制将会为其他蛋白酶稳定性的研究及改性提供重要的理论依据。本文以鲫鱼MBSP作为研究对象,首先在原核表达系统中获得重组MBSP包涵体,制备抗MBSP多克隆抗体;然后通过优化毕赤酵母表达载体、宿主及表达条件,建立适合的毕赤酵母表达体系;最后利用生物信息学分析、重叠延伸PCR及基因重组等技术手段,实现对鲫鱼MBSP基因的定点突变及重组表达;通过比较突变酶与野生型MBSP的酶学性质,确定影响MBSP稳定性的关键氨基酸残基,初步阐明其稳定性分子机制。采用基因重组技术,将鲫鱼MBSP基因借助表达载体pET-28a转入Rosseta宿主菌中,利用乳糖进行诱导表达,得到重组MBSP包涵体蛋白,通过亲和层析技术对其分离纯化后,免疫新西兰兔,从血清中获得了与MBSP发生特异性反应的高效价多克隆抗体。为了获得具有生物学活性的重组MBSP及其突变体,本文选择了毕赤酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA及其表达宿主GS115和SMD1168,采用基因重组技术构建了4种毕赤酵母表达体系,经Western blot和质谱鉴定发现,四种酵母表达体系共表达出3种分子量不同的重组MBSP,分别是28 kDa,33 kDa和36 kDa。其中SMD1168/pPICZαA-MBSP所表达的28 kDa重组MBSP与天然MBSP的分子量大小和酶学性质类似,表达背景蛋白少,且具有较高的稳定性而被确定为MBSP重组表达的最适毕赤酵母表达体系。表达条件的优化结果表明:诱导前菌体密度为5.0,甲醇添加量为1%(v:v),培养基pH为6.5,诱导4天时重组MBSP表达量最高。采用生物信息学分析手段,将鲫鱼MBSP序列与胰蛋白酶一级结构和三级结构进行比对,在其非保守区域预测了7个突变位点,设计了9个突变体。采用重叠延伸PCR和基因重组技术成功构建了9株突变体。通过对重组MBSP及其突变体的酶学性质研究表明,P95T突变体在65℃下的半衰期比野生型小,热稳定性较低,说明该位点是维持鲫鱼MBSP高热稳定性的关键氨基酸残基;突变体R125N可以提高MBSP的酸碱稳定性,说明位点R125是影响鲫鱼MBSP酸碱稳定性的关键位点之一;突变体A127S,I130D和A127S/I130D的热稳定性、酸碱稳定性及耐受变性剂的化学稳定性都比野生型高,说明位点A127和I130是影响该酶稳定性的关键位点。