【摘 要】
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CRISPR-Cas系统是原核生物基因组针对外源遗传物质的免疫系统,该系统可以利用一小段RNA(sgRNA)识别特定基因组位点进行靶位点切割。由于操作简单、成功率高,研究人员将其改造
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CRISPR-Cas系统是原核生物基因组针对外源遗传物质的免疫系统,该系统可以利用一小段RNA(sgRNA)识别特定基因组位点进行靶位点切割。由于操作简单、成功率高,研究人员将其改造为基因编辑工具。本课题利用Cas9的突变体dcas9与转录激活域VP64共同作用在sgRNA-guid的引导下激活靶基因的表达,从而把CRISPR-Cas系统改造为一种特异的转录激活工具。实验首先将一个缺失转录因子的min35s启动子克隆到Pcambia1380改载体(无kana抗性)上,我们称该载体为MP 1380,而后将β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因克隆到MP 1380载体上,让min35s启动子启动GUS基因,我们称此次构建好的载体为MGP 1380,将MGP 1380转入模式生物拟南芥中,稳定表达后用X-gluc对其幼苗进行染色,发现植株不变蓝,说明GUS基因没有表达。而后我们相继将dcas9-Vp64融合蛋白以及用U6启动子启动的sgRNA-guid克隆到同一个Pacmbia1380载体上,我们称该构建好的载体为DVP 1380,并转入上述已稳定表达MGP 1380载体的拟南芥。稳定表达后应用同样的方法染色,叶子变蓝。说明dcas9蛋白在sgRNA–guid的引导下可以和min35s启动子结合,将Vp64转录激活域带到GUS基因启动子的临近位置并激活GUS基因的表达。从而证明CRISPR-Cas系统可以作为一种有效的特异的转录激活或抑制的工具,这个发现对非编码RNA(nocoding RNA)的研究有很重要的意义。
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