离子束诱变环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株选育

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环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)及β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD)具有较大的应用价值。工业用CGTase均由微生物发酵产生,而β-CD是应用CGTase转化淀粉进行生产。我国CGTase及β-CD的生产虽有20多年的历史,由于生产菌种发酵产酶水平较低,CGTase及β-CD的生产成本过高导致市场价格偏高而使其应用受到一定的限制。 目前国内厂家生产菌种发酵30~40h,产酶水平为2000~4000 IU/mL。CGTase的生产成本约占β-CD整个生产成本的一半。应用离子束注入诱变技术对CGTase产生菌进行诱变,选育高产菌株,并研究高产菌株发酵产酶的最适发酵条件,以降低CGTase和β-CD的生产成本。 经过能量30keV、剂量范围1×1014~1×1016ions/cm2的氮离子注入诱变选育,得到产酶水平是出发菌株1.62倍的高产菌株B.sp.HA-1,该菌株经中科院微生物保藏中心鉴定为一新菌株。 经过发酵条件的优化,得到两个适宜的培养基配方和最佳培养条件。配方Ⅰ为糊精2%、玉米浆5%、k2HPO40.2%、(NH42SO4 0.02%;配方Ⅱ为玉米粉2%、玉米浆5%、k2HPO4 0.2%、MgSO4 0.02%。在培养基起始pH8~9,温度28℃的培养条件下发酵酶活力最高,增加接种量可以缩短发酵周期。应用配方Ⅰ,以10%接种量接种,在最佳培养条件下,高产菌株B.sp.HA-1摇瓶发酵24h产酶水平在6000IU/mL左右,40h产酶在7000IU/mL以上,最高达到8000IU/mL。 研究了高产菌株B.sp.HA-1产酶的传代稳定性。连续传20代,F2~F20代产酶水平是F1代的98.11%~102.66%,表明该菌株产酶具有良好的传代稳定性。 比较高产菌株和出发菌株产生的CGTase,发现两者之间的分子量或比活力均没有差异,认为诱变后菌株产酶水平的提高可能与CGTase基因的转录与表达增强有关。 对产自B.sp.HA-1菌株的CGTase进行纯化和酶学性质研究,结果表明该酶的分子量为71.9KDa;在60℃活力最高,55℃以下稳定性好,65℃的半衰期约为1h;在pH5~6时活力最高,pH5~11范围内较为稳定;金属离子Zn2+、Ag+、Hg2+、Cu2+、Fe2+、Al3+对CGTase的活性具有抑制作用。
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