研究背景及研究目的胃癌是消化系统最常见的肿瘤之一,给全球各地区造成了巨大的经济负担。亚洲的韩国、日本及我国的胃癌发病率高居不下,虽然在日本和韩国早期发现的筛查策略已被证明是成功的,但是包括我们中国在内的世界大部分地区仍然未能实现早期诊断,导致大部分患者被发现时胃癌已经进展,进而导致大部分患者不能仅依靠手术切除达到根治胃癌的效果。因此,手术外的其他治疗措施对于胃癌治疗起到重要作用。在这些措施中,化疗是主要的方法。化疗的出现显著地改善了肿瘤患者的生存质量及生存时间,但肿瘤化疗药物耐药的存在常常会导致患者化疗失败。化疗药物耐药包括以下两种:原发耐药及继发耐药。解决胃癌原发耐药及继发耐药的问题是现代肿瘤研究领域的一大难点。近十年,神经系统病变与肿瘤发生的关系逐渐受到重视。无论是临床观察,还是基础研究,都提示这两种看似并不相关的疾病背后存在某种联系,甚至存在共同的调节通路。Ataxin家族蛋白是一类能引起遗传性脊髓小脑型共济失调的蛋白。Ataxin蛋白常被异常插入多聚谷氨酰胺(polyQ)片段,导致神经系统病变。目前Ataxin家族蛋白在神经系统疾病中的研究国内外已经很多,但Ataxin在肿瘤领域的研究才刚刚兴起。最新研究发现,Ataxin-3通过抑制抑癌基因PTEN的表达,增强PI3K/Akt信号通路,促进肺癌;而ATXN2结合蛋白1(ATXN2binding protein 1,A2BP1)抑制胶质瘤的形成。这些都提示Ataxin家族蛋白在肿瘤研究中的价值有待进一步发掘。共济失调素-2样蛋白(Ataxin-2 like,ATXN2L)是引起遗传性脊髓小脑型共济失调的共济失调素(Ataxin-2,ATXN2)同源蛋白,二者的结构上高度相似,但不发生polyQ扩展。目前关于ATXN2L的研究报道非常少,仅已知ATXN2L只在胚胎组织、成人的睾丸及造血干细胞等永生化的细胞高表达;ATXN2L可与EpoR结合;ATXN2L过表达促进应激颗粒的产生。尽管ATXN2L的功能尚不清楚,但就ATXN2和ATXN2L的氨基酸序列进行比对,结果显示ATXN2L与ATXN2有三段高度相似的氨基酸序列(AA208-352,相似性60%;AA658-661,相似性100%;AA895-941,相似性60%)。在此基础上,ATXN2L具有ATXN2几乎所有特征性的功能域,包括:酸性结构域、Sm1、Sm2、Caspase-3切割位点等,提示该分子很可能在肿瘤发生中有重要作用。但是ATXN2L影响肿瘤进展的具体机制尚未清楚,有待进一步研究。实验方法与结果1.ATXN2L高表达是胃癌预后的重要因素我们分析TCGA数据库中的胃癌数据,发现ATXN2L的mRNA表达胃癌组织比癌旁组织高。我们提取新鲜胃癌组织标本蛋白行Western blot检测发现,胃癌组织的ATXN2L蛋白表达量高于癌旁组织。进一步,我们对南方医院167例Ⅰ-Ⅳ期胃癌患者的标本进行了免疫组化染色,并且对其中行根治性切除术的Ⅰ-Ⅲ期行无复发生存时间的随访,对行姑息治疗的Ⅳ期患者行总生存时间随访,发现患者ATXN2L的表达与肿瘤的分期、Ⅰ-Ⅲ期患者的术后复发及Ⅳ期患者的总生存时间的缩短存在明显的正相关关系。2.ATXN2L不影响胃癌的增殖,但促进迁移侵袭我们提取胃癌细胞株SGC7901,BGC823,AGS,MKN45,MGC803及永生化胃黏膜上皮GES-1的RNA行qPCR检测,发现在胃癌细胞株中较永生化胃黏膜上皮细胞株GES-1中ATXN2L表达量高。划痕实验及transwell实验发现,沉默了胃癌细胞中的ATXN2L后,胃癌细胞的迁移、侵袭能力减弱。荧光显微镜下观察细胞中EMT相关蛋白标志物发现,沉默细胞中的ATXN2L可以明显的增加细胞的上皮表型,抑制细胞的间质表型。在MTT及EDU实验中显示沉默ATXN2L后胃癌的增殖能力不受影响。3.ATXN2L抵抗奥沙利铂引起的细胞凋亡显微镜下观察发现用低浓度奥沙利铂可以诱导细胞向长梭形改变,但沉默ATXN2L后这种改变不明显。Annexin V-FITC/PI双染流式检测凋亡,沉默ATXN2L后,奥沙利铂刺激导致细胞的凋亡率增加。MTT实验测奥沙利铂敏感性,沉默ATXN2L后细胞对奥沙利铂的敏感性增加。克隆形成实验中,在加入奥沙利铂后细胞集落形成数目减少,沉默ATXN2L后细胞集落形成数目降低相比对照组明显。流式检测ROS含量中,奥沙利铂组增加胃癌细胞内活性氧产生,沉默ATXN2L后细胞内的活性氧产生较对照组增加明显。4.奥沙利铂通过ATXN2L引起应激颗粒形成免疫荧光实验中发现在不受外界刺激的条件下,细胞内的ATXN2L及应激颗粒分子指标G3BP1在细胞质中共定位,形成的应激颗粒很少,奥沙利铂刺激后细胞中的ATXN2L及G3BP1的表达升高,应激颗粒数目也明显增加,且随着奥沙利铂作用时间及作用浓度增加而增加。提取细胞中的RNA行qPCR发现,细胞中的ATXN2L的表达随着奥沙利铂刺激时间及浓度的增加而增加。沉默细胞中的ATXN2L的表达后,免疫荧光实验发现奥沙利铂刺激产生的应激颗粒的数目减少。5.沉默ATXN2L逆转继发性奥沙利铂耐药MTT实验证实实验室构建的奥沙利铂耐药株比敏感株对奥沙利铂的敏感性弱。Western blot检测中发现在奥沙利铂的耐药株中ATXN2L的表达比敏感株中的表达高。流式检测凋亡实验中,沉默奥沙利铂耐药株中的ATXN2L后,奥沙利铂耐药细胞株对奥沙利铂的敏感性增加。6.EGF通过PI3K/AKT信号通路促进ATXN2L的表达对GEO的两个胃癌数据集聚类分析发现,ATXN2L与胃癌EGFR及AKT信号通路可能相关。对GEO中5个数据集共751例胃癌患者生存分析中发现,ATXN2L/EGF双阴性的患者中位第一次疾病进展时间、中位总生存时间均显著长于ATXN2L/EGF双阳性的患者,而ATXN2L/EGF其中一者阳性另一者阴性的患者恰好夹在两条曲线中间。Western blot及qPCR,胃癌细胞受EGF刺激后,细胞内的ATXN2L随EGF刺激浓度升高表达升高,而加入PI3K抑制剂后细胞内的ATXN2L表达下降可以逆转EGF刺激的ATXN2L的升高。7.EGF通过ATXN2L调控下游功能划痕和transwell实验中发现,EGF刺激可以增加细胞的迁移和侵袭能力,沉默ATXN2L后,EGF增加细胞迁移和侵袭的能力部分受到抑制。在奥沙利铂耐药细胞中,qPCR检测发现ATXN2L中EGF及EGFR的表达较敏感株中高。MTT实验发现胃癌细胞中加入EGF刺激后对奥沙利铂的敏感性降低,同时沉默ATXN2L则细胞对奥沙利铂的敏感性部分逆转。结论ATXN2L在胃癌组织中的表达高于癌旁组织。ATXN2L的表达量与肿瘤的分期及不良预后相关。我们在细胞水平发现ATXN2L的表达与胃癌的增殖无关,沉默ATXN2L可以减弱胃癌细胞的迁移、侵袭的能力。沉默细胞中的ATXN2L后胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性增加,说明ATXN2L是胃癌奥沙利铂耐药的一个重要分子机制。而奥沙利铂的刺激可以导致细胞内形成应激颗粒,沉默ATXN2L后,奥沙利铂刺激形成的应激颗粒数目减少。说明ATXN2L可以通过调控应激颗粒的形成调控细胞对奥沙利铂的敏感性。在奥沙利铂耐药细胞株中,我们发现,沉默ATXN2L后胃癌对奥沙利铂的敏感性增加,说明ATXN2L在继发耐药中发挥重要作用。更深一步探讨胃癌组织中ATXN2L高表达的原因,我们发现肿瘤微环境中的EGF可以促进胃癌中ATXN2L的表达,EGF可以促进胃癌的迁移、侵袭,EGF可以降低胃癌细胞对奥沙利铂的药物敏感性。沉默ATXN2L后,EGF促进胃癌迁移、侵袭以及增加胃癌细胞对奥沙利铂抵抗的能力均可以部分被阻断,说明EGF部分通过增加胃癌细胞中ATXN2L的表达促进胃癌的进展及耐药。