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猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)感染引起猪的一种以急性出血性和慢性纤维素性胸膜肺炎病变为特征的呼吸道传染病。本病呈世界性分布,在欧洲、北美洲、南美洲、大洋洲及亚洲等地区养猪国家均有病例报道,特别是养猪业的规模化与集约化发展,危害程度日趋严重,已成为影响现代养猪业健康发展的重要传染病之一。1987年我国首次报道本病,1996年蔡一鸣等通过流行病学调查、临床症状观察、大体病理学检查和病原学鉴定等首次证实本病在我省的存在。本研究开展了以下几个方面的工作:1.贵州省猪传染性胸膜肺炎血清学调查:采用间接凝集试验对2007年841份和2008年1056份猪血清样本进行猪传染性胸膜肺炎血清抗体检测,结果显示:2007年免疫猪群和非免疫猪群抗体阳性率分别为63.6%和50.3%,其中种猪场、规模养猪场、养殖小区、散养户和屠宰场猪群相应为45.4%、60.2%、44.4%、25.0%和46.8%,而在哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和种猪中的血清抗体阳性率分别为47.6%、30.3%、62.2%和60.0%。2008年免疫猪群和非免疫猪群抗体阳性率分别为78.5%和38.0%,其中种猪场、规模养猪场、养殖小区、散养户和屠宰场猪群相应为36.2%、52.2%、28.6%、12.5%和41.8%,而在哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和种猪中的血清抗体阳性率分别为37.1%、23.5%、47.4%和42.7%。这些结果表明,该病的免疫预防效果良好,在贵州省不同饲养方式猪场以及不同生长阶段猪群已普遍存在猪传染性胸膜肺炎感染。2.猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测技术研究:根据Genebank收录的猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂白A基因保守序列,设计合成了1对引物,对猪胸膜肺炎放线杆菌参考菌株和其它种属菌株进行PCR检测,并比较了不同的模板提取方法,结果显示:建立的PCR方法对9个血清型猪胸膜肺炎放线杆菌菌株均能扩增出与预期大小相一致的339bp特异性条带,而对支气管败血波氏杆菌、奇异变形杆菌、都柏林沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等均呈阴性反应,且其模板最小检出量可达到0.14ng;同时SDS-蛋白酶K法、煮沸法和枪尖法提取的DNA模板对该PCR方法的扩增效果影响不明显。这些结果表明,本实验成功建立了特异、敏感的猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法,为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断提供了技术支持。3.猪胸膜肺炎放线杆菌PCR分群研究:根据Genebank收录的不同血清型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂白A基因序列的差异,设计合成了4对引物(即相同上游引物与不同下游引物),对猪传染性胸膜肺炎疫苗菌株、其它参考菌株和不同血清型猪胸膜肺炎放线杆菌进行PCR检测,结果显示:建立的PCR分群方法对猪传染性胸膜肺炎疫苗菌株可扩增出983bp、666bp和382bp大小的三条DNA带,与该疫苗所含血清型(Ⅰ、Ⅱ和Ⅶ血清型)预期扩增条带大小相一致;对上述其它种属参考菌株均呈阴性反应;对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ等9个血清型猪胸膜肺炎放线杆菌均能扩增出相应的目的条带(983bp、666bp、382/415bp和591bp)。这些结果表明,本实验建立的多重PCR方法,可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌血清群的划分。4.猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因克隆与序列测定:根据Genebank收录的猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因保守序列,设计合成1对引物,对血清Ⅰ型猪胸膜肺炎放线杆菌进行PCR扩增,并将扩增产物克隆至pMD-18T,经转化与鉴定后,送至大连宝生物公司测序,结果显示:该引物对血清Ⅰ型猪胸膜肺炎放线杆菌可扩增出与预期大小相一致(约为620bp)的特异性DNA条带;对扩增产物的重组pMD-18T载体进行PCR和双酶切鉴定结果均正确(分别约为624bp和624bp/2700bp);经测序,扩增片段大小为624bp,该片段序列与Genebank上参考菌株相应序列的同源性达100%。5.猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因原核表达及其初步鉴定:将上述扩增ApxⅣ基因片段克隆至pET32a载体,转化BL21(DE3)大肠杆菌进行诱导表达,并对表达产物进行免疫反应性鉴定,结果显示:经蓝白斑菌落筛选和PCR反应证实本实验成功构建了猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因片段的重组pET32a-ApxⅣ载体;经转化BL21(DE3)大肠杆菌进行诱导表达,该基因片段的表达蛋白量达到全菌蛋白的22%,最佳表达时间为4.5h,最佳IPTG诱导剂量为1.0mmol/L;Western Blotting证实该表达蛋白能与猪传染性胸膜肺炎阳性血清发生特异性反应,具有较好的免疫活性,为猪传染性胸膜肺炎血清学诊断技术研究奠定了基础。