【摘 要】
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目的:构建包含心脏肌钙蛋白T启动子(cTnT启动子)和miR361-PSR(hCGin-miR361-PDE9AshRNA)表达框的重组质粒,包装6型重组腺相关病毒(rAAV6-cTnT-miR361-PSR),体外转导原代心肌细胞,应
【出 处】
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北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部
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目的:构建包含心脏肌钙蛋白T启动子(cTnT启动子)和miR361-PSR(hCGin-miR361-PDE9AshRNA)表达框的重组质粒,包装6型重组腺相关病毒(rAAV6-cTnT-miR361-PSR),体外转导原代心肌细胞,应用RNA干扰原理,下调PDE9A基因的表达,观察原代心肌细胞中PDE9A基因mRNA和蛋白水平的变化。 方法:⑴构建基于miRNA361骨架靶向下调PDE9A表达的shRNA片段(miR361-PSR片段),与质粒pAAV-cTnT-null进行双酶切(BamHⅠ、NotⅠ),将得到酶切片段连接构成重组质粒pAAV-cTnT-miR361-PSR。⑵将pAAV-cTnT-miR361-PSR重组质粒、pAAV6包装质粒及辅助质粒,共转染293细胞,获得rAAV6-cTnT-miR361-PSR病毒。用SDS-PAGE测定病毒纯度和Dot Blot法测定病毒滴度。⑶重组病毒rAAV6-cTnT-miR361-PSR转导乳鼠原代心肌细胞,提取mRNA和蛋白质,用RT-PCR和Western Blot法测定PDE9A基因的表达水平的变化。 结果:①成功构建pAAV-cTnT-miR361-PSR重组质粒。②成功包装rAAV6-cTnT-miR361-PSR重组病毒。③rAAV6-cTnT-miR361-PSR重组病毒转导原代心肌细胞后PDE9A基因的mRNA和蛋白量均明显低于对照组。 结论:成功包装rAAV6-cTnT-miR361-PSR重组病毒体外转导原代心肌细胞,明显下调PDE9A基因和蛋白的表达。
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