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目的黑色素瘤相关抗原蛋白PRAME参与细胞生长、细胞免疫和细胞内信号转导等多种生命活动。PRAME蛋白在多种类型肿瘤中广泛表达,与乳腺癌、黑色素瘤以及白血病等多种疾病进程密切相关。尽管目前对于PRAME蛋白功能的研究取得了一定进展,但是对于PRAME蛋白表达调控的机制却还尚未可知。本课题首次发现细胞内PRAME蛋白发生多聚泛素化修饰。本文将研究PRAME蛋白在细胞内的降解途径以及找到调控PRAME蛋白水平的去泛素化酶,目的在于揭示细胞内PRAME蛋白受到的泛素化和去泛素化修饰调控。方法1、利用蛋白酶体抑制剂MG132和Cullin蛋白活化抑制剂MLN4924处理Huh7、MCF7等多种细胞系,6h后检测细胞内源PRAME的蛋白水平。2、利用放线菌酮CHX处理MCF7和A375细胞,检测细胞内源PRAME蛋白的降解情况。3、构建PRAME蛋白表达质粒,并与泛素Ub质粒共同转染293T细胞,检测PRAME蛋白的泛素化情况;构建PRAME蛋白截短体表达质粒,分别检测不同截短体蛋白的泛素化情况。4、将PRAME蛋白表达质粒分别与Cullin家族蛋白表达质粒共同转染293T细胞,检测PRAME蛋白与Cullin家族蛋白之间是否存在相互作用;构建PRAME蛋白的VHL-box结构域缺失体,并检测PRAME蛋白缺失VHL-box结构域后与Cullin家族蛋白之间的相互作用。5、将PRAME蛋白表达质粒分别与Cullin-RING-E3连接酶复合物的核心成员RBX蛋白（RBX1、RBX2）的表达质粒共同转染293T细胞,检测二者之间是否存在相互作用。6、检测PRAME蛋白是否影响Cullin家族蛋白的活化。7、构建Cullin蛋白的sh RNA表达质粒并将其分别包装成慢病毒感染MCF7细胞,Western blot检测细胞内PRAME蛋白的水平。8、将实验室构建的96个去泛素化酶表达质粒分别包装成慢病毒感染MCF7细胞,利用Western blot检测MCF7细胞PRAME的蛋白水平,筛选能够调控MCF7细胞内源PRAME蛋白水平的去泛素化酶。9、筛选得到去泛素化酶USP51使MCF7细胞内PRAME的蛋白水平上升,构建USP51酶活突变体表达质粒USP51-mut,检测USP51及USP51-mut蛋白对于MCF7细胞内源PRAME蛋白水平的影响以及对于PRAME蛋白半衰期的影响。10、将PRAME蛋白表达质粒与USP51的表达质粒共同转染293T细胞,检测这两个蛋白之间的相互作用。11、将PRAME、泛素Ub表达质粒分别与USP51或USP51-mut表达质粒共同转染293T细胞,检测细胞内USP51及USP51-mut蛋白对于PRAME蛋白泛素化水平的影响。12、将PRAME、内参蛋白表达质粒与一些信号通路报告基因共同转染MCF7细胞,检测通路的荧光信号强度并筛选出受到PRAME蛋白影响的信号通路。13、将USP51、PRAME、内参蛋白表达质粒以及筛选得到的两个通路的报告基因共同转入MCF7细胞,检测PRAME蛋白与USP51蛋白对通路的荧光信号强度的影响。结果1、MG132和MLN4924使细胞内PRAME的蛋白水平上升。2、PRAME蛋白在细胞内通过蛋白酶体降解。3、PRAME蛋白在细胞内发生多聚泛素化修饰且这一过程主要依赖于它的N末端和LRR结构域。4、PRAME蛋白与Cullin蛋白各成员之间存在相互作用,但PRAME蛋白的VHL-box结构介导PRAME与CUL2蛋白而非Cullin蛋白家族其它成员之间的相互作用。5、PRAME蛋白与Cullin-RING-E3连接酶复合物的核心成员RBX蛋白之间存在相互作用。6、PRAME蛋白不影响Cullin蛋白的活化。7、在MCF7细胞中敲低任一Cullin蛋白不能使PRAME蛋白水平升高。8、筛选得到去泛素化酶USP51使MCF7细胞内源PRAME蛋白水平升高。9、USP51蛋白使MCF7细胞内源PRAME蛋白水平升高,而其酶活突变体USP51-mut则失去这种能力;USP51蛋白能够有效延长PRAME蛋白的半衰期,而USP51-mut则不能。10、PRAME蛋白与USP51蛋白之间存在相互作用。11、细胞内的USP51蛋白能够去除PRAME蛋白的多聚泛素链,而USP51-mut则不具有这种能力。12、筛选发现PRAME蛋白能够使氨基酸饥饿反应通路和热休克反应通路的荧光信号增强。13、USP51蛋白对于氨基酸饥饿反应信号通路和热休克反应信号通路的影响与PRAME蛋白一致。结论PRAME蛋白在细胞内发生多聚泛素化修饰并通过泛素——蛋白酶体系统降解,并且它的泛素化修饰主要依赖于N末端和LRR结构域。PRAME蛋白与Cullin-RING-E3连接酶复合物之间存在相互作用。去泛素化酶USP51依赖其去泛素酶活性水解PRAME蛋白的多聚泛素链,调控细胞内PRAME的蛋白水平。PRAME蛋白和USP51蛋白均参与调控氨基酸饥饿反应通路和热休克反应通路的信号转导。