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ras基因作为经典癌基因之一,从其被发现以来一直备受关注,即使到现在对它的研究热潮也未曾削减。其中主要原因是因为p21Ras蛋白在许多信号通路中处于中枢地位,调控着细胞的增殖、分化和存活,约33%的人类癌细胞中存在ras基因突变。因此,对ras基因或p21Ras蛋白进行干预在治疗癌症领域具有非常广阔的应用前景。目前以ras基因为靶点的治疗策略主要有反义寡核苷酸和RNA干扰技术,而以p21Ras蛋白为靶点的治疗主要基于免疫治疗。免疫治疗因具有高效的靶向性和安全性,在杀伤癌细胞时基本上不损伤正常组织,被认为是未来癌症治疗中最具前景的治疗技术。选择抗p21Ras蛋白抗体可以中和p21Ras蛋白,阻断ras信号通路,达到治疗与ras基因或蛋白异常相关癌症的目的。本实验室以野生Hp21Ras蛋白作为抗原构建出了广谱抗p21Ras单克隆抗体,并在单克隆抗体基础上构建出广谱抗p21Ras的KGH-R1-ScFv单链抗体。实验室前期工作证明KGH-R1-ScFv单链抗体对多种高表达p21Ras蛋白肿瘤具有很好抑制作用,但对于肿瘤中高表达的p21Ras蛋白是突变型还是野生型尚不清楚。为了最大限度地发挥该单链抗体在治疗Ras相关肿瘤中的作用,必须阐明其免疫反应谱。本实验目的是从蛋白和细胞两个水平上研究KGH-R1-ScFv单链抗体与各种p21Ras蛋白各亚型的免疫反应活性:1、与三种野生型p21Ras蛋白各亚型的免疫反应性;2、与七种突变型p21Ras蛋白的免疫反应性;3、与四种已知p21Ras类型的肿瘤细胞的免疫反应性。第一步,原核表达野生H、N和K-p21Ras蛋白及突变型Kp21RasG12S、Kp21RasG12V、Kp21RasG13D、Np21RasQ61K、Np21RasG12C、Np21RasQ61R、Hp21RasG12V蛋白;第二步,原核表达KGH-R1-ScFv单链抗体;第三步,酶联免疫吸附法(ELISA)检测KGH-R1-ScFv单链抗体与野生型p21Ras蛋白和突变型p21 Ras蛋白之间的免疫反应性;第四步,细胞免疫荧光实验检测KGH-R1-ScFv与已知p21Ras类型的肿瘤细胞(MD-MB-231人乳腺癌细胞、A549人肺癌细胞、SW480人结肠癌细胞、HuH7人肝癌细胞)的免疫反应性;第五步,Western Blotting实验检测进一步验证KGH-R1-ScFv单链抗体与肿瘤细胞p21Ras蛋白免疫反应性。ELISA法结果表明KGH-R1-ScFv单链抗体与野生型的H、N、K-p21Ras蛋白和突变型 p21Ras 蛋白(Kp21RasG12S、Kp21RasG12V、Kp21RasG13D、Np21RasQ61K、Np21RasG12C、Np21RasQ61R 蛋白)都结合,但实验发现与突变的Hp21RasG12V蛋白免疫反应结果为阴性。根据酶标仪读取的蛋白浓度和吸光度值绘制ELISA四参数拟合曲线,结果显示KGH-R1-ScFv单链抗体与突变型Kp21Ras蛋白的免疫结合力高于突变型Np21Ras蛋白,与野生型Hp21Ras、Kp21Ras和Np21Ras蛋白都具有较高的免疫结合力。对实验室已知p21Ras类型的肿瘤细胞进行细胞免疫荧光实验,根据荧光定位结果表明KGH-R1-ScFv单链抗体与Kp21RasG13D的MD-MB-231人乳腺癌细胞、Kp21RasG12S的A549人肺癌细胞、Kp21RasG12V的SW480人结肠癌细胞和NRas突变的HuH7人肝癌细胞都免疫结合。裂解以上4种肿瘤细胞并收集肿瘤细胞蛋白,随后进行Western Blotting实验,结果再次验证KGH-R1-ScFv单链抗体与肿瘤细胞的p21Ras蛋白都结合。本实验完善了 KGH-R1-ScFv单链抗体与p21Ras蛋白免疫反应谱,对后续该单链抗体与其他药物联合治疗肿瘤提供了理论依据,另外实验结果对以KGH-R1-ScFv单链抗体治疗特定突变类型的肿瘤提供了强有力的证据。