【摘 要】
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由松材线虫(Pine Wood Nematode,PWN)引起的松材线虫病给传入地的林业造成毁灭性的生态灾害和重大经济损失,引起世界多个国家的高度关注,目前已被40多个国家列为重点检疫对象。松材线虫为我国重大林业入侵有害生物,其种群增长和扩散传播极其迅速,目前在我国发生区已由南方松林扩大至东北地区。目前防治策略以清理病死木和防治媒介天牛为主,尚无有效可直接应用的防控PWN的方法。由于化学农药对人类
【基金项目】
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国家自然基金青年科学基金项目“基于组学探究生防真菌 Esteya vermicola吸引松材线虫的分子机理(31800547)”;
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由松材线虫(Pine Wood Nematode,PWN)引起的松材线虫病给传入地的林业造成毁灭性的生态灾害和重大经济损失,引起世界多个国家的高度关注,目前已被40多个国家列为重点检疫对象。松材线虫为我国重大林业入侵有害生物,其种群增长和扩散传播极其迅速,目前在我国发生区已由南方松林扩大至东北地区。目前防治策略以清理病死木和防治媒介天牛为主,尚无有效可直接应用的防控PWN的方法。由于化学农药对人类健康、环境和生物的不利影响,生物防治PWN对国家可持续林业健康发展具有重大的战略意义。伊氏线虫真菌Esteya vermicola是目前研究的最为广泛的PWN生防真菌,是世界上第一个被报道的寄生PWN的真菌。E.vermicola通过释放挥发性物质吸引PWN,并以新月形孢子粘附并侵染PWN,室内的防治效果表明E.vermicola是极具潜力的PWN生防真菌。但对吸引阶段E.vermicola响应PWN的转录表达尚不清楚,对不同营养条件下E.vermicola的转录和代谢差异亦不清楚。本论文从E.vermicola吸引PWN阶段进行研究,揭示PWN存在时E.vermicola转录表达的变化,挖掘了E.vermicola响应PWN的关键遗传因子;亦研究了富碳富氮不同营养条件下E.vermicola侵染PWN相关基因表达的差异。本论文的研究为PWN重要生防真菌E.vermicola的高毒力遗传改良研究提供具有价值的基因资源。主要研究结果如下:(1)通过PWN诱导E.vermicola试验设计和试验,获得诱导前后具有明显差异的E.vermicola表型,PWN诱导E.vermicola后,第1d菌落背面开始加黑,之后菌落生长加快,气生菌丝发达加厚,菌落正面逐渐变绿、菌体量增加。并随诱导时间的增长而持续的变化。处理组自PWN诱导的前4d,处理组的生长速度大于对照组,对照组与处理组的菌落直径仅相差0.2cm左右。第4d开始迅速生长,生长至第10d,处理组比对照组菌落直径大2.6cm,比对照菌落直径大50%。PWN诱导处理的菌落整体变成绿色,而对照则是边缘浅绿,中心白色。(2)分析PWN诱导E.vermicola的差异转录组,发现该诱导过程通过MAPK信号传导途径快速传导至E.vermicola胞内,并上调表达接受PWN信息素的受体基因;E.vermicola上调表达GLEYA蛋白结构域、CFEM蛋白结构域、WSC蛋白结构域及凝集素等细胞表面的粘附蛋白,为更好的粘附PWN做准备;E.vermicola上调表达枯草杆菌蛋白酶、丝氨酸蛋白酶S28、角质酶转录因子、PWN体壁降解酶,为穿透线虫角质层侵染PWN做准备;有助于真菌致病的黑色素合成基因也显著上调;E.vermicola可能通过昆虫信息素合成途径释放挥发性物质吸引PWN。(3)获得了PWN生防真菌E.vermicola在富碳富氮不同培养条件下的转录组数据,分析了差异表达基因和特异表达基因。富氮培养条件下的E.vermicola真菌不仅生长迅速,而且富氮培养条件下的E.vermicola真菌表达的总基因数量和特异表达的基因数量高于富碳培养条件下的基因表达。具有杀线虫作用的枯草杆菌蛋白酶、毒素合成等相关基因在富氮培养显著上调。富氮培养条件有利于E.vermicola菌丝的延伸生长及高毒力基因的表达。(4)富碳、富氮不同培养条件下E.vermicola代谢物显著差异。磷酸胍基乙酸酯和对甲酚硫酸盐是富氮培养条件下大量产生的特有代谢物,分别为富碳培养下的5628倍和5438倍。富氮培养条件下比富碳培养下能够产生更丰富的代谢产物。多数代谢物在富氮条件下上调,泛醌和其他萜类醌的生物合成代谢途径被显著富集。代谢产物光色素、吲哚、尿囊素和海藻糖在富氮条件下显著上调,光色素和吲哚可能是细菌真菌间的信号分子,尿囊素和海藻糖可能分别做为氮、碳源供给E.vermicola真菌胞内共生细菌利用。综上所述,本文对PWN存在但未接触时E.vermicola的基因表达进行了分析,探讨了E.vermicola相应PWN信号的受体基因及信号转导途径,及粘附和侵染阶段相关基因的表达情况,为E.vermicola强吸引和高毒力的遗传改良提供了一批宝贵的基因资源。通过富碳富氮营养不同下E.vermicola生长、转录和代谢的比较研究,发现适于E.vermicola迅速生长和高毒力因子表达的富氮培养基。为野外大规模的E.vermicola培养和应用提供了理论基础,并探讨了生防真菌E.vermicola和其胞内共生细菌之间可能的信号分子。
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