论文部分内容阅读
目的：从生化实验和细胞实验水平,运用分子生物学技术,探讨VPO1对NO的氧化机制及VPO1在内皮细胞NO代谢中的作用。方法：实验分为三部分：(1)体外实验：用探针法实时监测VPO1与NO的反应,以及Cl-或Br-对该反应的影响,并用Griess试剂检测该反应的氧化产物。(2)用NO分析仪检测GJ-4细胞(稳定转染了VPO1的HEK293细胞)内的NO水平,并通过APF荧光检测法检测细胞内VPO1的活性。(3)通过Western Blot检测各种血管活性物质刺激后内皮细胞VPO1, Nox-4, iNOS的蛋白表达情况,以及内皮细胞中的NO含量。结果：(1)体外实验发现VPO1能与NO发生反应,氧化产物之一为硝酸盐；Cl-和Br-能竞争性抑制MPO对NO的消耗,而Cl-对VPO1与NO反应无明显影响。(2)GJ-4细胞中的NO含量明显低于对照组,而VPO1的活性明显高于对照组。(3)LPS(100ng/ml)和TNF-a(2ng/ml)刺激内皮细胞(HUVEC)24小时后,VPO1蛋白表达水平有不同程度升高。在HMEC-1细胞中,BK(1μM)与Ach(10μM)可呈时间依赖性的降低Nox-4和升高iNOS的蛋白表达。TNF-a(2ng/ml)刺激内皮细胞24小时后,细胞内NO含量明显低于对照组。结论：VPO1是NO的氧化酶。细胞内VPO1(?)消耗内源性NO,参与NO代谢。TNF-a能通过上调VPO1的表达参与调控内皮细胞的NO代谢。