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【目的】脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是目前医学界最具挑战性的难题之一,随着社会发展,人口老龄化加剧,SCI发病率逐年增高,然而临床上却没有有效的治疗策略。单一的治疗方案并不能有效地改善患者运动及感觉功能的恢复,寻求行之有效的治疗方式尤为重要。SCI后损伤部位神经元缺失是导致患者功能受损的重要原因,神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)移植治疗可能是目前研究提出的最佳移植选择。然而,在损伤部位移植的NSCs的存活和神经发生仍然很低。二甲双胍(Metformin),作为临床用于治疗Ⅱ型糖尿病的常用药物,能有效改善糖尿病后神经损伤。本课题拟通过二甲双胍干预脊髓来源NSCs体外实验等探索二甲双胍对NSCs增殖,分化和成熟的多重作用以及二甲双胍联合NSCs移植治疗方案的可能性并初步研究二甲双胍潜在的作用机制。【方法】体外培养脊髓来源NSCs,通过不同浓度梯度(0nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM)二甲双胍干预NSCs,通过WST-1实验、Tuj-1免疫荧光染色、RT-PCR等方法,分析不同浓度二甲双胍对NSCs活性、增殖、分化等方面的影响,确定二甲双胍最适干预浓度及其安全性。应用Western blot检测二甲双胍干预后,细胞内AMPK、p-AMPK的表达水平,探索二甲双胍是否通过激活AMPK发挥对NSCs的作用。为探索二甲双胍是否通过影响NSCs外泌体(exosomes)分泌而产生作用,本实验分为三组:(1)1μM二甲双胍干预NSCs后收集条件培养基提取外泌体进而影响NSCs分化(EXO-Met)组;(2)不应用二甲双胍干预NSCs收集条件培养基提取外泌体进而影响NSCs分化(EXO-Ctr)组;(3)无外泌体干预(Control)组。本实验运用超速离心方法提取外泌体,运用Western blot、Zetaview等方法鉴定外泌体,应用外泌体干预NSCs,通过Tuj-1免疫荧光染色等方法分析对NSCs分化的影响。应用二甲双胍联合外泌体抑制剂干预NSCs分化进而探索其对NSCs分化的影响。Western blot检测干预后,细胞内AMPK、p-AMPK的表达水平,探索二甲双胍是否通过外泌体激活AMPK发挥对NSCs的作用。【结果】WST-1测定显示,二甲双胍促进NSCs增殖、增强细胞活力,浓度范围为0.01至10μM。免疫荧光染色结果显示二甲双胍促进NSCs产生更多Tuj-1阳性神经元。具体而言,当用1μM二甲双胍处理NSCs时,新分化的神经元表现出更长的神经突。在二甲双胍干预后,RT-PCR检测到NSCs中神经源性基因的更高转录水平。Western blot结果显示AMPK表达无显著变化,p-AMPK表达显著上调。Western blot鉴定外泌体相关标志物Alix、CD81阳性,GAPDH阴性。Zetaview-NTA结果提示二甲双胍干预条件下能够促进NSCs外泌体分泌。与Control组相比,EXO-Met组与EXO-Ctr组均能促进NSCs产生更多Tuj-1阳性神经元,均表现出更长的神经突。Western blot结果显示AMPK表达无显著变化,p-AMPK表达显著上调。应用外泌体抑制剂可以抑制二甲双胍对AMPK的激活作用。【结论】二甲双胍可以促进NSCs的增殖,分化和成熟。表明二甲双胍与NSC移植联合使用方案用于治疗脊髓损伤的可能性,并可能是通过激活AMPK发挥作用。二甲双胍可能通过影响神经干细胞外泌体(exosomes)分泌,并可能是通过激活AMPK从而发挥促进神经干细胞分化的作用。