碱性蛋白酶指在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶,最适p H在9～11之间。其活性中心大都含丝氨酸,又称丝氨酸蛋白酶。广泛应用于洗涤剂、食品、丝绸、制革、医疗等行业。目前,国外大公司垄断着蛋白酶制剂品,国内企业有生产但是酶产量低、价格昂贵、酶学性质不理想等问题使企业盈利低,因此,如何提高菌株的产酶能力和发酵条件的优化依然是研究的热点问题。本实验以河南仰韶生化工程有限公司的2709碱性蛋白酶菌株为研究对象,利用多种诱变方法选育出高产菌株,研究其酶学性质,并进行工艺优化。1.选育碱性蛋白酶高产菌株从碱性蛋白酶菌株2709分离出一株产酶稳定的菌株Y9（15582 U/m L）。对菌株Y9进行了诱变选育,结果发现,当紫外线为30 W,距离20 cm时,诱变60 s,正突变率较高;利用硫酸二乙酯与紫外线对菌株进行复合诱变,用浓度1.5%的硫酸二乙酯处理30 min后进行紫外诱变;又利用常压室温等离子体诱变技术对菌株进行诱变,气源用氩气,功率为100 W,诱变时间为70 s时,正突变率较高。菌株用多种诱变方法反复诱变,最后获得一株碱性蛋白酶高产菌株A59,其酶活为23485 U/m L,通过遗传稳定性分析,发现遗传稳定性较好。该菌株与出发菌株相比,酶活提高了50.72%。2.碱性蛋白酶酶学性质的研究对菌株A59所产碱性蛋白酶进行酶学性质的初步研究。结果发现,该酶的最适作用温度为55～60℃;酶的最适作用p H为9～11;温度在45℃以下时,酶具有良好的热稳定性;p H在8～10.5之间时,具有较好的p H稳定性和耐碱性;该酶对1 mol/L的H₂O₂具有较强的抗氧化性;Ca²⁺、Mn²⁺可稍微提高酶活,Fe²⁺、Zn²⁺几乎完全抑制酶反应,Mg²⁺、Na⁺、K⁺对酶活无明显影响。通过酶学性质研究,发现该菌株与出发菌株的酶学性质几乎一致,说明该菌株的酶成分几乎没有什么改变。3.碱性蛋白酶高产菌株发酵工艺的研究以菌株A59为研究对象,通过对影响该菌株的9个因素进行研究,结果发现,当豆粕粉3.6%、玉米粉5.2%、磷酸氢二钠浓度0.8%、Mg²⁺浓度0.15%、吐温-80浓度0.12%、接种量5%时,酶活为36829 U/m L。在这些因素中,影响产酶最显著的因素是Na₂HPO₄浓度、Mg²⁺浓度、吐温-80浓度。对这些因素进行3因素5水平的响应面试验,结果发现,当Na₂HPO₄浓度0.9115%、Mg²⁺浓度0.1593%、吐温-80浓度0.09%时,菌株的预测酶活达到38758.626 U/m L。该条件下,通过进一步验证,酶活为38650 U/m L,提高了64.57%。通过对菌株A59进行发酵动力学分析可知,培养到42 h,菌株的酶产量到最高值38650 U/m L,比出发菌株发酵时间提前了4 h左右。4.碱性蛋白酶的发酵罐试生产以摇瓶优化工艺为基础,对A59进行放大试验。优化后,1 m³发酵罐的发酵工艺参数为:装料系数0.7,接种量5%,温度38℃,溶氧维持在20%～30%,此时,转速200 r/min,通风量1:0.5～1:2.5。发酵液p H值7.0。在32 h时,酶活力最高。通过8批次试验,平均酶活为52000 U/m L。根据液相体积传氧系数k_L·a相同原则放大到5 m³发酵罐,将溶氧控制在20%～30%。发酵时间约为30 h,产酶性能稳定,通过5批次试验,平均酶活为52764 U/m L,可以用于工业生产。通过35 m³发酵罐的放大试验,溶氧控制在20%～30%,此时,搅拌转速160 r/min,通风量1:0.5～1:2.5。发酵时间约为29 h,通过8批次试验,酶活平均达到52784 U/m L,产酶性能稳定。与小试的发酵动力学曲线对比,提前3 h达到最大产酶量,缩短了发酵时间。