研究背景和目的急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)及其更严重阶段急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)是临床危重症发生急性呼吸衰竭的主要原因,病死率高达50%。ALI/ARDS发病机制错综复杂,目前为止尚未完全阐明,各种以肺为靶目标的的传染病、生物化学损伤、严重外伤与创伤后感染、休克、中毒均可成为ALI的主要发病因素,其病理基础均表现为肺内失控的炎症反应所致的肺毛细血管膜损伤,肺水肿及透明膜形成。虽然机械通气和全身激素治疗在一定程度上延缓了ALI/ARDS的进展,但是目前临床仍缺乏针对ALI/ARDS的有效免疫调控及肺保护手段。由于参与ALI炎症反应及氧化应激损伤的介质众多,且彼此相互联系、互为因果,在治疗过程中针对单一介质的单克隆抗体、拮抗剂、抑制剂等均未取得满意的防治效果。此外,炎症介质为机体所必需,过多或不足均会造成损害,而使用抑制剂等剂量与时机很难把握,常使此类研究陷入困境。核因子Kappa B (Nuclear Factor Kappa B, NF-кB)信号通路是启动炎症反应的关键通路,在感染及创伤等多种因素诱发的炎症反应及氧化应激损伤中起重要作用。NF-кB是广泛存在于细胞浆中的一种快反应转录因子,静息状态下,NF-кB与其抑制因子IκB结合以无活性的三聚体形式存在于细胞浆。当细胞受到细胞因子、促炎介质、病毒及细菌分解物等外界刺激后,NF-кB被激活并迅速从细胞浆转位到细胞核,在胞核内与相应基因上的κB位点发生特异性结合,调控细胞因子、化学趋化因子、生长因子、粘附分子、诱生型一氧化氮合成酶和协同刺激分子等相关基因的表达,进而参与机体炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等。抑制INF-кB活化不仅可以降低炎症损伤,还可以同时减弱氧化应激,减少细胞组织的损伤。已有研究证明抑制NF-кB活化可以明显地降低脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)所致的感染性休克小鼠死亡率。本课题组前期研究与其他国外研究均显示抑制NF-кB过度活化可减少TNF-α诱导的肺泡上皮细胞炎症反应、氧化应激损伤及凋亡。因此,我们推测,NF-кB是连接ALI炎症反应与氧化应激的重要节点,对NF-кB的活性进行调控是同时下调ALI炎症反应与减轻氧化应激损伤的关键。通过抑制IκB激酶(IкBkinase,IKK)活性进而下调NF-кB活化程度是当前研究ALI/ARDS干预策略的热点。IKK对IκB的磷酸化是NF-кB活化的关键步骤,是NF-кB在炎症反应过程中激活的经典途径。IKK由IKKα、IKKβ和IKKy三个亚单位组成,其中IKKy又称NEMO,是IKK的调节亚单位。研究证实IKK活化经典的NF-кB信号通路依赖IKKy的完整性。目前已经有了针对IKK调节亚单位NEMO的结合肽(NEMO Binding Domain Peptide, NBD), NBD可与NEMO特异性结合从而阻断IKK复合物的组装并下调IKK活性,进而抑制NF-кB活化。但是如何把稳定的具有生物学活性的NBD靶向导入到肺脏以及如何把握NBD使用剂量与给药时机,以便更好低改善ALI失控的炎症反应和氧化损伤,目前未见相关研究。在药剂学领域,使用药物载体是改善药效,提高药物靶向性与减少药物不良反应的一种措施。本研究拟利用外源性肺泡表面活性物质(Pulmonary Surfactant, PS)包封NBD,再经气管内雾化的形式靶向肺部给药,在提高药物稳定性的同时,能更大可能性地改善NBD对肺组织的亲和力和促进NBD进入肺结构细胞以抑制NF-кB信号通路的活化,而外源性PS则可补充炎症反应或氧化应激中损失的肺泡表面活性物质,以协同达到纠正ALI病理损伤、维持正常呼吸功能的目的。综上所述,本课题的研究目的如下：1采用气管内雾化、气管内滴入和腹腔注射LPS复制ALI小鼠模型,评估LPS经不同给药方式致小鼠肺组织病理损伤及炎症反应程度,选则手术创伤小、操作简便且最接近ALI病理特点的小鼠模型。2确定最佳造模方式之后,不同剂量的NBD经气管内雾化预处理0.5h,评价NBD预处理对ALI小鼠肺组织过度炎症反应及氧化应激损伤的影响。3选择合适剂量的NBD充分溶解于外源性PS,探讨NBD联合PS预处理对ALI小鼠肺组织过度炎症反应的影响及作用机制。方法1LPS经不同给药方式致ALI小鼠模型的比较研究12周龄,SPF级雄性BLAB/c小鼠随机分为正常对照组(NC group)、气管内雾化组(ITA group)、气管内滴入组(ITI group)和腹腔注射组(IPI group),每组21只。NC组小鼠腹腔注射0.1mL水合氯醛麻醉后气管内雾化喷入100μL空气；ITA组小鼠麻醉后气管内雾化喷入LPS溶液100μL(1mg/mL);ITI组小鼠麻醉后气管内滴入LPS溶液100μL(1mg/mL);IPI组小鼠腹腔注射LPS溶液100μL(1mg/mL)。ITA组和ITI组各取3只小鼠用伊文斯蓝溶液取代LPS溶液以显示气管内雾化和滴入时药物的肺内分布。LPS给药2h后麻醉并剪断腹主动脉放血处死全部小鼠,充分暴露胸腔,分别取肺组织行干湿重比、HE染色及病理评分；ELISA检测小鼠支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)中TNF-α和IL-1p浓度；Real-time RT-PCR检测小鼠肺组织TNF-α和IL-1β mRNA转录水平；Western Blot检测小鼠肺组织IкB-α蛋白含量及IкB-α和NF-кBp65蛋白磷酸化水平。2NBD预处理对LPS诱导ALI小鼠过度炎症反应及氧化应激的影响12周龄,SPF级雄性BLAB/c小鼠随机分为对照组(control)、模型组(model)、NBD阴性对照组(N-NBD)、NBD低剂量组(S-NBD)、NBD中剂量组(M-NBD)和NBD高剂量组(L-NBD),每组18只。对照组小鼠腹腔注射0.1mL水合氯醛麻醉后气管内雾化喷入100μL空气；模型组小鼠麻醉后气管内雾化LPS溶液100μL (1mg/mL); NBD阴性对照组及NBD低中高剂量组小鼠麻醉后分别经气管内雾化喷入相应剂量的NBD阴性对照溶液及NBD溶液50μL,0.5h后再次经气管内雾化LPS溶液50μL (2mg/mL), LPS给药2h后麻醉并剪断腹主动脉放血处死全部小鼠。充分暴露胸腔取小鼠全肺组织行病理切片、HE染色及病理评分,ELISA检测小鼠BALF中TNF-α和IL-1β浓度；Real-time RT-PCR检测肺组织TNF-α、IL-1β、NOX1、NOX2和NOX4mRNA转录水平；Western Blot检测肺组织IкB-α、NOX1、NOX2、NOX4蛋白含量及IкB-α、NF-кB p65蛋白磷酸化水平；比色法检测肺组织超氧化物歧化酶活力(Superoxide Dismutase, SOD)、总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity, T-AOC)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)浓度。3NBD联合PS预处理对LPS诱导ALI小鼠过度炎症反应及信号通路的影响12周龄,SPF级雄性BLAB/c小鼠随机平均分为对照组(control)、模型组(model)、PS组、PS+(N-NBD)组、PS+NBD组和NBD组,每组12只。对照组及模型组小鼠造模方法同第二章；PS和NBD组小鼠麻醉后气管内雾化相应剂量的单药PS和NBD50μL0.5h后,再次经气管内雾化LPS溶液50μL(2mg/mL); PS+(N-NBD)和PS+NBD组小鼠麻醉后经气管内雾化相应剂量的PS+(N-NBD)和PS+NBD混合制剂50μL0.5h后,再次经气管内雾化LPS溶液50μL (2mg/mL)。 LPS给药2h后麻醉并剪断腹主动脉放血处死全部小鼠,ELISA检测小鼠BALE中TNF-α和IL-1p浓度,Real-time RT-PCR检测肺组织TNF-α和IL-1β mRNA转录水平,Western Blot检测肺组织IкcB-α、NF-кB、P38MAPK, ERK1/2和JNK蛋白表达及磷酸化水平。4统计学处理应用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±S)表示。所有数据均进行方差齐性检验,组间均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。方差齐时多重比较采用LSD检验法,方差不齐时多重比较采用Dunnett’s T3检验法,显著性水准α取0.05,双侧。结果1LPS经不同给药方式致ALI小鼠模型的比较研究1.1气管内雾化伊文斯蓝溶液的小鼠肺组织蓝染区域较分散,呈点状或斑片状分布于各肺叶。气管内滴入伊文斯蓝溶液的小鼠肺组织蓝染区域分布较集中,主要集中在主气管两侧,呈块状分布,部分标本的伊文斯蓝溶液仅分布于个别肺叶,其余肺叶则未见蓝染。1.2各组小鼠肺组织湿/干重比例差异有统计学意义(F=39.512, P<0.001)。ITA组、ITI组和IPI组肺湿/干重比例均显著高于NC组(P均<0.001),而ITA组、ITI组和IPI组之间差异无统计学意义(P均>0.05)。1.3各组小鼠肺组织病理评分差异有统计学意义(F=80.84,P<0.001)。ITA组、ITI组和IPI组病理评分均显著高于对照组(P均<0.001),其中ITA组和ITI组均显著高于IPI组(P=0.001和P=0.002),而ITA组和ITI组之间差异无统计学意义(P=0.054)。NC组小鼠肺泡结构清晰,肺泡壁薄,肺间质无炎症细胞浸润。ITA组小鼠各肺叶均存在弥漫性的肺泡间隔增厚与肺泡壁破坏,肺间质炎症细胞浸润与出血,血管床不同程度破坏。ITI组小鼠部分肺叶结构破坏严重,部分肺叶结构相对完整,肺叶之间病灶不均匀。IPI组小鼠在肺泡结构、血管床破坏程度和炎症细胞浸润方面均较轻,1.4各组小鼠BALF中TNF-a和IL-1β浓度差异有统计学意义(F=102.737,F=28.259,P<D.001)。ITA组、ITI组和IPI组TNF-a和IL-1p浓度均较NC组增高,差异有统计学意义(P均<0.001)。ITA组和ITI组TNF-a浓度均显著高于IPI组(P=0.001),而ITA组和ITI组比较差异无统计学意义(P=0.386)。ITA组IL-1β浓度显著高于ITI组和IPI组(P=D.008和P<D.001),ITI组又显著高于IPI组(P=0.044)。1.5各组小鼠肺组织TNF-α和IL-1β mRNA转录水平差异有统计学意义(F=86.498,F=129.033,P均<0.001)。ITA组、ITI组和IPI组TNF-α和IL-1β mRNA转录水平均较NC组增高,差异有统计学意义(P均<0.001)。ITA组TNF-α mRNA转录水平显著高于ITI组和IPI组(P=0.016和P<0.001),而ITI组又显著高于IPI组(P=D.D2)。ITA组IL-1β mRNA转录水平显著高于ITI组和IPI组(P=0.02和P<0.001),ITI组又显著高于IPI组(P<0.001)。1.6各组小鼠肺组织IкB-α蛋白含量及IкB-α、NF-кB p65磷酸化水平差异有统计学意义(F=38.500,F=56.193,F=15.220,P均<0.001)。ITA组、ITI组和IPI组IкB-α蛋白含量均较NC组减少,差异有统计学意义(P<0.001,P<0.001和P=0.016)。ITA组和ITI组IкB-α磷酸化水平均较NC组显著增加(P均<0.001),而IPI组和NC组间差异无统计学意义(P=0.526)。ITA组和ITI组NF-кBp65磷酸化水平均较NC组显著增加(P<0.001和P=0.002),而IPI组和NC组间差异无统计学意义(P=0.164)。ITA组IкB-α蛋白含量均显著低于ITI组和IPI组(P=0.023和P<0.001),而ITI组又显著低于IPI组(P=0.003)。ITA组IкB-α磷酸化水平显著高于ITI组和IPI组(P=D.009和P<0.001),ITI组又显著高于IPI组(P<0.001)。ITA组和ITI组肺组织NF-кBp65磷酸化水平均显著高于IPI组(P=0.002和P=0.019),而ITA和ITI组比较差异无统计学意义(P=0.138)。2NBD预处理对LPS诱导ALI小鼠过度炎症反应及氧化应激失衡的影响2.1各组小鼠肺组织病理评分差异有统计学意义(F=69.594,P<0.001)。LPS给药2h后,模型组病理评分显著高于对照组(P<0.001)。给予NBD预处理0.5h,NBD低中高剂量组病理评分均较模型组降低,差异有统计学意义(P=0.019,P<0.001和P<0.001)。NBD中剂量组和高剂量组病理评分均显著低于NBD低剂量组(P=0.038和P=0.004),而NBD高剂量组与中剂量组相比差异无统计学意义(P=0.246)。对照组小鼠肺泡结构清晰,肺泡壁薄,肺间质无炎症细胞浸润。模型组和NBD阴性对照组小鼠各肺叶均存在弥漫性的肺泡间隔增厚、肺泡壁破坏以及肺泡塌陷,肺间质炎症细胞浸润与出血,血管床不同程度破坏。给予低中高剂量NBD预处理0.5h,可以显著减轻LPS诱导的肺组织病理损伤,并且NBD的肺组织保护作用呈现浓度依赖性增强。2.2各组小鼠BALF中TNF-α和IL-1β浓度差异有统计学意义(F=104.414,F=110.934,P均<0.001)。LPS给药2h后,模型组TNF-α和IL-1β浓度均较对照组升高,差异有统计学意义(P均<0.001)。给予NBD预处理0.5h, NBD低中高剂量组’TNF-α和IL-1p浓度均较模型组降低,差异有统计学意义(P均<0.001)。NBD低中高剂量组间TNF-α浓度呈浓度依赖性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。NBD中剂量组和高剂量组IL-1β浓度均低于NBD低剂量组,差异有统计学意义(P均<0.001),而NBD高剂量组与中剂量组相比无统计学差异(P=0.099)。2.3各组小鼠肺组织TNF-α和IL-1β mRNA转录水平差异有统计学意义(F=118.309,F=129.174,P均<0.001)。LPS给药2h后,模型组TNF-α和IL-1β mRNA转录水平均较对照组升高,差异有统计学意义(P均<0.001)。给予NBD预处理0.5h, NBD中剂量和高剂量组TNF-α和IL-1β mRNA转录水平均较模型组显著降低(P均<0.001)。NBD低中高剂量组间TNF-α和IL-1β mRNA转录水平呈浓度依赖性降低,差异有统计学意义(P<D.05)。2.4各组小鼠肺组织IкB-α蛋白含量及IкB-α、NF-кB p65蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(F=84.342, F=222.636, F=247.138, P均<0.001)。LPS给药2h后,模型组IкB-α蛋白含量较对照组显著减少(P<0.001),而IкB-α和NF-кB p65磷酸化水平均较对照组显著增加(P均<D.001)。给予NBD预处理0.5h, NBD低中高剂量组IкB-α蛋白含量均较模型组增加,差异有统计学意义(P均<0.001),而IкB-α和NF-кB p65磷酸化水平均较模型组减少,差异有统计学意义(P均<0.001)。NBD中剂量组IкB-α蛋白含量较NBD低剂量组显著增高(P=0.035),而NBD高剂量组与低中剂量组比较差异均无统计学意义(P=0.628和P=0.085)。NBD低中高剂量组间肺组织IкB-α和NF-кBp65蛋白磷酸化水平呈浓度依赖性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.5各组小鼠肺组织SOD、T-AOC和MDA浓度差异有统计学意义(F=71.710,F=7.416,F=45.965,P均<D.001)。LPS给药2h后,模型组SOD和T-AOC浓度均较对照组显著降低(P均<0.001),而MDA浓度较对照组显著增高(P均<0.001)。给予NBD预处理0.5h,NBD中剂量组和高剂量组SOD和T-AOC浓度均较模型组显著增高(P均<0.01),而NBD低剂量组与模型组比较差异均无统计学意义(P=0.236和P=0.165)。NBD低中高剂量组MDA浓度均较模型组降低,差异有统计学意义(P=0.01,P<0.001和P<0.001)。NBD中剂量组和高剂量组MDA浓度均较NBD低剂量组降低,差异有统计学意义(P均<0.001),而NBD中剂量和高剂量组之间比较差异无统计学意义(P=D.63)。2.6各组小鼠肺组织NOX1、NOX2和NOX4mRNA转录水平差异有统计学意义(F=79.146, F=22.826, F=55.446, P均<D.001)。LPS给药2h后,模型组NOX1、 NOX2和NOX4mRNA转录水平均较对照组显著升高(P均<D.001)。给予NBD预处理0.5h, NBD低中高剂量组NOX1、NOX2和NOX4mRNA转录水平均较模型组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。NBD中剂量组和高剂量组NOX1、 NOX2和NOX4mRNA转录水平均显著低于NBD低剂量组(P均<0.05),而NBD高剂量组与中剂量组比较差异无统计学意义(P=D.334,P=0.911和P=0.119)。2.7各组小鼠肺组织NOX1、NOX2和NOX4蛋白表达水平差异有统计学意义(F=137.291,F=8.256,F=162.843,P均<D.D1)。LPS给药2h后,模型组NOX1、 NOX2和NOX4蛋白表达水平均较对照组增加,差异有统计学意义(P=D.022、P<0.001和P<0.001)。给予NBD预处理0.5h,NBD中剂量组和高剂量组肺组织NOX1和NOX2蛋白表达水平均较模型组显著减少(P均<0.01),而NBD低剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P=0.111和P=0.123),NBD低中高剂量组NOX4蛋白表达水平均较模型组显著减少(P均<0.001)。NBD低中高剂量组间NOX1蛋白表达水平呈浓度依赖性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。NBD高剂量组NOX2蛋白表达水平较NBD低剂量组显著降低(P=D.006),而NBD中剂量与与低剂量组比较差异无统计学意义(P=0.112)。 NBD中剂量组和高剂量组NOX4蛋白表达水平均较NBD低剂量组显著降低(P均<D.001),而NBD中剂量和高剂量组之间比较差异无统计学意义(P=D.142)。3PS联合NBD预处理对LPS诱导ALI小鼠过度炎症反应的影响及机制研究3.1各组小鼠BALF中TNF-α和IL-1p浓度差异有统计学意义(F=80.065,F=49.220,P均<0.001)。LPS给药2h后,模型组TNF-α和IL-1β浓度均较对照组显升高,差异有统计学意义(P均<0.001)。PS组、NBD组和PS+NBD组TNF-α和IL-1β浓度均较模型组降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。PS+NBD组TNF-α和IL-1β浓度均较PS组显著降低(P<0.001和P=0.002),而PS+NBD组与NBD组之间无统计学意义差异(P=0.606和P=0.544)。3.2各组小鼠肺组织TNF-α和IL-1β mRNA转录水平差异有统计学意义(F=80.057,F=65.830,P均<0.001)。LPS给药2h后,模型组TNF-α和IL-1βmRNA转录水平较均较对照组显著升高(P均<0.001)。PS组、NBD组和PS+NBD组TNF-α和IL-1βmRNA转录水平均显著低于模型组(P均<0.001)。PS+NBD组TNF-α mRNA转录水平均较PS和NBD单药组显著降低(P<0.001和P=D.002),而IL-1β mRNA转录水平仅较PS组显著降低(P<0.001),与NBD组相比差异无统计学意义(P=0.111)。3.3各组小鼠肺组织iкB-α蛋白含量及IкB-α、NF-кBp65蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(F=49.981, F=35.166, F=25.220, P均<0.001)。LPS给药2h后,模型组IкB-α含量较对照组显著减少(P<0.001),而IкB-α和NF-кBp65磷酸化水平均较对照组显著增加(P均<0.001)。PS组、NBD组和PS+NBD组IкB-α含量均较模型组显著增加(P均<D.001),而IкB-α和NF-xBp65磷酸化水平均较模型组显著降低(P均<0.001)。PS+NBD组IKB-α含量较PS组显著增加(P=0.021),而与NBD组相比差异无统计学意义(P=0.26)。PS+NBD组IкB-α和NF-кBp65磷酸化水平均较PS和NBD组显著降低(P均<0.05),而PS组和NBD组之间差异无统计学意义(P=0.953和P=0.849)。3.4各组小鼠肺组织P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(F=36.678,F=6.659,F=6.056,P均<0.001)。LPS给药2h后,模型组P38MAPK、ErK1/2和JNK磷酸化水平均较对照组显著增加(P均<0.001)。PS组肺组织P38MAPK磷酸化水平较模型组显著减少(P=0.011),而PS+NBD组和NBD组与模型组相比,差异均无统计学意义(P=0.946和P=0.253)。PS组ERK1/2磷酸化水平与模型组相比差异无统计学意义(P=0.055),而PS+NBD组和NBD组均较模型组显著降低(P=0.001和P=0.01)。PS组、NBD组和PS+NBD组JNK磷酸化水平均较模型组显著降低(P=0.045,P=0.005和P=0.001),而PS组、NBD组和PS+NBD组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.与气管内滴入和腹腔注射相比,气管内雾化能使LPS更加均匀地分布于小鼠肺内,显著增加LPS与肺组织的有效接触面积,引起更强烈的炎症放大反应,造成更严重的肺组织损伤,从而更接近ALI病理过程,而且气管内雾化LPS具有手术创伤小、操作简便等特点,是复制ALI小鼠模型的优选方案。2.给予适当剂量的NBD预处理,可以有效抑制LPS诱导的ALI小鼠肺组织内NF-кB信号通路的正反馈性放大,进而明显减轻肺组织炎症反应和氧化应激损伤,保护肺组织结构细胞。3.NBD联合PS预处理,不仅可以显著下调炎症反应信号通路中MAPKs磷酸化水平,抑制NF-кB环路的正反馈性放大,减少TNF-α和IL-1β等促炎介质表达,进而减轻肺组织炎症损伤,而且外源性PS可以有效补充因过度炎症反应和氧化应激而丢失的内源性PS。二者联合使用,具有协同抗炎效果。