前言：　　 Wnt信号传导通路(Wntsignalingpathway)在进化过程中保持稳定,广泛存在于生物的信号传递系统中,已经证实的生物有线虫,斑马鱼,果蝇,非洲爪蟾,老鼠等等,在人类的信息传递系统中更是发挥着重要作用,已证实在中枢神经系统中广泛分布。Wnt信号通路的假说根据其受体及产生效应的不同主要分为三种,其中研究比较深入的是经典Wnt通路,又称Wnt/β-连环蛋白(β-catenin,β-cat)通路。研究表明,经典Wnt/β-cat通路激活后通过破坏β-cat降解复合物的形成使β-cat的保持稳定并积累于细胞质内,继而进入细胞核激活靶基因表达。经典Wnt/β-cat通路在生物早期发育和器官演化过程中有着举足轻重的调节作用,主要作用有调节细胞的增殖,生长和迁移。通常情况下,随着生物体的发育成熟,大部分器官内的Wnt信号通路功能逐渐减退,β-cat的浓度维持在较低水平。但是有研究表明,β-cat和Wnt信号传导通路的重要因子在脑组织中仍然大量存在。研究发现,在成熟的机体中,Wnt信号通路的作用则是维持细胞生长状态的稳定。过度的刺激或者抑制该通路的正常生理功能均能产生相应的疾病,如肿瘤发生和发展,阿尔兹海默疾病。近年的研究发现,它还与化学物质中毒也有一定的相关性,如重金属中毒等等。　　 糖原合成激酶3β(glycogensynthasekinase3p,GSK3β)最初发现于能量代谢过程中,主要的生化作用是对相应蛋白质的磷酸化作用。研究发现在Wnt信号传导通路中,GSK3β也发挥着举足轻重的作用。经典Wnt信号传导通路中,GSK3β在Wnt蛋白的调控下与细胞内膜的低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5/6,LRP5/6)-轴蛋白(Axin)相结合,从而使β-cat逃离被磷酸化继而降解的命运。细胞质内稳定的β-cat通过细胞核孔进入细胞核,与T细胞转录因子/淋巴细胞增强因子(T-celltranscriptionfactor/lymphoidenhancerfactor,TCF/LCF)相结合,启动下游基因的表达,产生相应生物学效应。因此,在经典Wnt信号传导通路中是一个重要的切入点。　　 总的来说,在Wnt细胞传导通路中β-cat是连接细胞外刺激和细胞内变化的重要信号因子,而β-cat发挥其信号传导功能主要取决于它在细胞质内的量和存在的位置。分子生物对β-cat的结构及功能域研究表明,其核心功能区域的蛋白三维结构有12个β-折叠,其中的丝氨酸/苏氨酸位点为GSK3β的磷酸化位点。　　 ARMC6(Armadillorepeatcontaining6)是细胞中能与GSK3p结合的蛋白之一,由转染Flag-GSK3β载体的HEK293细胞匀浆液经过α-Flag抗体免疫共沉淀,并使用液相色谱串联质谱仪(liquidchromatography-tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)对免疫共沉淀所获得的蛋白样品进行检测而被发现,已证实在人类基因组中存在。科学家测定ARMC6纯化蛋白的晶体结构发现它具有6个β-折叠,与β-cat的12个β-折叠相似,因而推测ARMC6可能在Writ信号通路中也有发挥一定的功能,但是目前还没有相关的研究报道。因此对于ARMC6的基本功能亟待研究。　　 对象和方法：　　 由于本实验主要是针对ARMC6基本功能的研究,本实验拟采用体外实验的方式,在细胞水平上研究ARMC6在Wnt信号通路中的作用基础。采用的细胞主要是既能贴壁也能悬浮生长的HEK293T细胞系。　　 首先,从NCBI数据库获得不同种属的ARMC6的基因和氨基酸序列,比较不同种属间ARMC6氨基酸序列的同源性。另外,以相应的基因序列为模板,设计相应的PCR扩增引物序列,以人类cDNA文库,果蝇全基因DNA等为模板,使用PCR技术获得目标序列,并插入适合的载体中扩增和保存。成功合成的载体经基因测序证明准确后,将载体浓度调整至1μg/μl,4℃保存,用于对目的基因的表达和功能研究。　　 其次,利用构建成功的hARMC6和hGSK3β载体,在HEK293T细胞内表达,利用免疫共沉淀和Westernblotting技术研究hARMC6和hGSK3β以及Wnt信号传导通路中的相关作用。并且利用纯化的hARMC6和hGSK3B蛋白,根据体外激酶试验后放射性标记的ATP的存在与否,来判断对hARMC6的磷酸化能力。进一步验证hARMC6和hGSK3β之间的相互关系。　　 再次,构建一系列不同种类的hARMC6变异型研究hARMC6蛋白核心区域6个Arm重复序列的具体功能,研究在HEK293T细胞中异位表达的变异型的hARMC6与hGSK3β的相互关系,进一步研究hARMC6与hGSK3β相互作用的具体部位。　　 最后,按照与hGSK3β相同的实验条件研究hARMC6和Wnt信号通路其他因子之间的相关关系,进一步确认hARMC6在Wnt信号通路中的作用。根据体外细胞实验中hARMC6与Wnt信号传导通路中重要因子之间的关系,初步判断ARMC6在Wnt信号传导通路中的作用,并为以后的整体动物实验提供理论依据。　　 结果：　　 首先,不同种属间ARMC6氨基酸序列的同源性比较发现,其蛋白核心区域(即6个Arm重复序列)的同源性水平较高。与人类ARMC6氨基酸序列核心区域相比,老鼠,非洲爪蟾和果蝇的同源性分别为95.7%,87.1%和66.0%。　　 其次,在HEK293T细胞中异位表达的hARMC6和hGSK3β表现出一定程度的相关性。在体外激酶试验中,纯化蛋白hGSK3β可以磷酸化hARMC6。　　 再次,所构建的变异型hARMC6与hGSK3β的关系研究发现,hAR_D_1A,hAR_D_1B和bAR_D_2A与hGSK3p不相连,而hAR_D_2B和bAR_D_3与hGSK3β有相关性。　　 最后,在同样的实验条件下,ARMC6与Wnt信号传导通路的其他因子表现出程度不同的相关性(与APC相关,但不能与Axin和β-cat免疫共沉淀),与β-cat的反应关系略有不同。　　 结论：　　 首先,同源性检测说明ARMC6的核心区域在进化过程中保持稳定,推测在细胞生理功能中有重要的作用。其次,异位表达的hARMC6和hGSK3β有相关性,体外激酶试验hGSK3β可以磷酸化hARMC6则进一步说明hARMC6和hGSK3β存在相互作用,ARMC6可能通过这个途径参与Wnt信号传导通路。再次,变异型hARMC6与hGSK3β的反应关系说明,hARMC6的6个Arm重复序列参与与hGSK3β反应,其中第二个和第三个Arm重复序列作为一个整体参与反应。最后,hARMC6仅与hAPC存在相关性,这和β-cat的反应关系有不同之处。这表明ARMC6在体外研究的水平上在参与经典的Wnt/β-cat信号传导通路,但具体的功能还需要更加深入的研究。