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背景和目的:糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)作为糖尿病的严重并发症之一,是糖尿病性微血管病变在眼部的特征性表现,并逐渐成为主要的致盲性眼病。DR的病理基础是:长期高血糖导致视网膜微血管受损、缺血,诱发视网膜新生血管形成和血视网膜屏障破坏,进而出现增殖性玻璃体视网膜病变及眼底出血,破坏视力。在这个机制中,起主要作用的细胞因子是血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),DR的发生发展过程提示VEGF在DR病程中发挥重要作用。目前临床DR的治疗主要包括:针对原发病的治疗、激光封闭视网膜无灌注区、玻璃体切除机化血管及近些年来用于临床的抗VEGF的治疗等。由于以上治疗方法均仅对已有病变起到延缓作用,而难以修复已经受损的血管和组织。因此,积极寻求修复病变血管的治疗措施,成为新的治疗策略。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因具有多向分化潜能及旁分泌作用,为DR的治疗提供了新的可能。大量研究表明,MSC能积极参与组织损伤的修复。靶器官受损后,MSCs趋化移行到损伤处[1],分泌多种因子,包括营养因子、炎症因子等[2],部分细胞分化为靶组织细胞,参与组织修复[6-10]。鼠尾静脉或玻璃体腔注射脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)均可改善DR鼠的视网膜功能[11,12]。这为开展BM-MSCs治疗DR临床试验提供了坚实的转化医学依据。近年来研究发现VEGF可分为两大家族,包括促进血管生长因子家族VEGFxxx,以及抑制血管生长因子家族VEGFxxxb[3,4]。在眼内,VEGF165、VEGF165b分别为VEGF亚型中促进血管生长因子和抑制血管生长因子的代表[5]。目前关于MSCs的基础及临床课题多倾向于对MSCs分泌神经营养因子的研究,尽管已有研究报道,UC-MSCs和BM-MSCs均分泌VEGF[13],但关于其分泌的血管因子VEGF眼内主要亚型VEGF165和VEGF165b,尚未见到离体和在体的系统研究。鉴于此,本研究提出以下设想:BM-MSCs可能通过改变血浆及眼部新生血管相关因子(VEGF165与VEGF165b)表达来发挥对dr的视网膜血管再生及修复作用。同时,因为新生血管的形成是受网络体系及多种因子调节的[17]。而由于体内新生血管的形成主要受促进/抑制新生血管相关因子体系的影响,基于眼内主要的vegf亚型代表是vegf165和vegf165b,本研究为了解体内抑制/促进新生血管形成代表因子之间博弈的最终结果,进一步对比移植前后vegf165/vegf165b的比例变化,初步了解bm-mscs对dr治疗产生的影响。本研究在充分伦理论证的基础上,通过体外实验,观察人bm-mscs分泌新生血管相关因子(vegf165与vegf165b)情况,进而在临床体内试验中,观察自体bm-mscs静脉输注对dr患者两种新生血管相关因子(vegf165与vegf165b)表达及二者比值的影响,进而对bm-mscs治疗dr的可能机制做出初步分析。方法:1人mscs中新生血管相关因子表达及含量的研究1.1人bm-mscs细胞和人uc-mscs细胞培养及鉴定1.2探索人mscs中新生血管相关因子的mrna表达半定量反转录-聚合酶链反应(semiquantitativereversetranscriptase-polymerasechainreaction,sqrt-pcr)。首先自行设计、合成引物,抽提两种细胞中的rna,然后用提取的rna反转录获得互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacidcdna),以cdna为模板扩增做sqrt-pcr。1.3人mscs分泌新生血管相关因子的蛋白水平检测酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassayexperiment,elisa)。用抗人vegf165b、vegf165试剂盒定量分析检测分泌的各蛋白表达量。2dr患者输注自体bm-mscs前后体内新生血管相关因子表达变化的研究2.1纳入患者输注自体bm-mscs符合课题设计试验方案纳入标准的10例dr患者,进行全身静脉输注移植自体bm-mscs治疗。2.2输注自体bm-mscs前后房水中新生血管相关因子表达的检测10例进行自体bm-mscs全身静脉输注治疗的dr患者,分别采集房水标本约200ul。采集时间点:移植术前、术后2月。检测方法:elisa试剂盒。2.3输注自体bm-mscs前后血浆中新生血管相关因子表达的检测10例已进行自体bm-mscs全身静脉输注移植的dr患者,采集静脉血,分离血浆。采集时间点:移植术前、术后1月、术后3月。检测方法:elisa试剂盒。结果:1.人骨髓间充质干细胞和人脐带间充质干细胞均表达vegf165、vegf165b因子,其中后者表达的vegf165、vegf165b的量均大于前者。表明在分泌血管活性因子方面,人bm-mscs及人uc-mscs均表现出了潜能,但后者的分泌功能明显优于前者,提示在治疗dr的策略中,人uc-mscs较人bm-mscs可能更有活性。2.制定和完善间充质干细胞人体试验过程中每例患者房水、血液标本的采集、分离及保存流程,为本课题组下一步开展的间充质干细胞在其它眼底疾病的研究奠定基础。3.自体bm-mscs静脉输注治疗dr后2月,患者房水中vegf165的含量降低,而vegf165b未见明显变化。表明bm-mscs治疗后,dr患者的房水中主要表现为促新生血管因子降低。在促进/抑制新生血管相关因子的体系中,bm-mscs治疗后,房水中vegf165/vegf165b的比值下降,说明bm-mscs最终的综合作用结果表现为抑制视网膜新生血管形成。提示自体bm-mscs可能通过调控眼内新生血管相关因子的表达,对dr视网膜新生血管的生成产生抑制效果。4.自体bm-mscs静脉输注治疗dr后1、3月,患者血浆中vegf165的含量降低,而vegf165b未见明显变化。表明bm-msc治疗后,dr患者的血浆中主要表现为促新生血管因子降低。在促进/抑制新生血管相关因子的体系中,bm-msc治疗后,体内vegf165/vegf165b的比值下降,说明bm-mscs最终的综合作用结果可能表现为抑制缺血组织新生血管形成。提示bm-mscs可能通过调控体内血管活性因子的表达,从而对糖尿病受损靶组织(包括视网膜)新生血管的生成产生抑制效果。结论:1、本研究通过比较学发现,人bm-mscs和人uc-mscs均表达新生血管相关因子vegf165、vegf165b,且后者较前者具有更强大的新生血管相关因子分泌功能。研究提示,在mscs治疗缺血性病变的临床应用的候选细胞中,人ucmscs较人bm-mscs更具活性。2、本研究率先观察到dr患者经自体bm-mscs静脉输注治疗后,房水中的vegf165含量下降,且vegf165/vegf165b比值下降。表明bm-mscs可以调控dr患者眼局部新生血管相关因子的表达;且在新生血管相关因子调控体系中,改变vegf165/vegf165b比例,最终综合作用表现为抑制视网膜新生血管形成,从而对dr患者的视网膜起到保护作用。3、本研究首次观测到DR患者经自体BM-MSCs全身输注治疗后,全身VEGF165水平下降,且VEGF165/VEGF165b比值下降。显示BM-MSCs在DR患者体内,可以调控DR患者全身新生血管相关因子的表达;且在新生血管相关因子调控体系中,可能通过改变VEGF165/VEGF165b比例,最终综合作用表现为抑制新生血管形成,改善糖尿病微血管病变。揭示自体BM-MSCs的新生血管相关因子可能对全身的微循环系统均起到保护作用。这将为BM-MSCs治疗糖尿病微循环障碍,特别是糖尿病视网膜病变机制的研究提供新的线索和实验基础。