论文部分内容阅读
目的基于CYP1B1/HIF1α/VEGFA轴研究芪白平肺（QBPF）胶囊干预慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺泡上皮细胞凋亡的作用机制。方法第一部分QBPF胶囊防治COPD的关键靶点预测借助生物信息学分析方法,分析比较正常对照和COPD患者肺组织芯片数据,获取差异表达基因（DEGs）;检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库,获取QBPF胶囊的主要活性成分和靶基因。将DEGs映射到QBPF胶囊靶基因,以构建QBPF胶囊防治COPD的“QBPF胶囊-靶基因”网络,并对网络中的靶基因进行蛋白互作（PPI）、hub基因、富集通路分析,研究QBPF胶囊防治COPD的主要作用靶点和通路;进一步通过基因集富集分析（GSEA）,分析COPD显著富集通路,获取QBPF胶囊防治COPD的关键通路。第二部分QBPF胶囊干预COPD模型大鼠的体内实验研究采用香烟烟熏（CS）联合脂多糖（LPS）气管滴注法构建COPD模型大鼠;苏木精-伊红染色（HE）法检测大鼠肺组织病理改变,评价QBPF胶囊对模型大鼠肺部炎症和肺气肿改善作用;酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清IL-1β、TNF-α、NF-κB、IL-4、IL-10水平,评价QBPF胶囊对模型大鼠全身炎症反应的改善作用;RT-PCR法检测大鼠肺组织HIF1α、CYP1B1、VEGFA的表达,分析QBPF胶囊对这些DEGs的影响;TUNEL法检测大鼠肺泡上皮细胞凋亡情况,评价QBPF胶囊对模型大鼠肺泡上皮细胞凋亡的改善作用;免疫荧光法观察HIF-1信号通路中关键蛋白HIF1α和ARNT的肺部定位和表达情况。第三部分QBPF胶囊含药血清干预香烟烟雾提取物（CSE）诱导的肺泡上皮细胞体外实验研究采用CSE诱导肺泡上皮细胞A549构建COPD体外实验模型。CCK8法检测CSE对A549细胞活力的影响,并结合RT-PCR法检测不同浓度CSE干预A549细胞下HIF1α的表达,筛选最佳CSE造模时间和浓度;CCK8法检测QBPF胶囊含药血清对A549细胞活力的影响,筛选最佳的QBPF胶囊含药血清干预时间和浓度;DCFH-DA探针检测细胞内活性氧（ROS）水平,评价QBPF胶囊含药血清对CSE诱导A549细胞内ROS的影响;TUNEL法检测细胞凋亡,评价QBPF胶囊含药血清对CSE诱导A549细胞凋亡的影响;免疫荧光法检测HIF-1信号通路关键蛋白HIF1α和ARNT的表达和细胞定位情况;HIF1α敲低慢病毒感染A549细胞,以构建HIF1α敲低的A549细胞株;Western blot法检测HIF1α、VEGFA、ARNT、CYP1B1、β-actin的蛋白表达,评价QBPF胶囊含药血清对HIF-1信号通路关键蛋白表达的影响。结果第一部分QBPF胶囊主要靶向HIF-1通路1研究共纳入96个正常对照和204个COPD患者肺组织芯片原始数据,差异基因分析结果发现2375个上调DEGs（校正P值＜0.05）和3878个下调的DEGs（校正P值＜0.05）;2研究获取到QBPF胶囊的242个活性成分和244个靶基因,其中157个活性成分靶向COPD的HIF1α、VEGFA、CYP1B1等91个DEGs,且这些DEGs显著富集于HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等30条通路;3 HIF-1信号通路是QBPF胶囊主要靶向通路之一,且该通路中HIF1α、VEGFA是QBPF胶囊靶基因中排名前3的hub基因;第二部分QBPF胶囊可影响CYP1B1/HIF1α/VEGFA轴关键分子的表达,改善COPD大鼠肺泡上皮细胞凋亡1 HE结果发现,COPD模型大鼠肺组织结构破坏,且肺泡平均线性截距（AMLI）显著升高;TUNEL结果表明,COPD模型大鼠肺泡存在大量的凋亡细胞;ELISA结果发现COPD大鼠血清炎性指标IL-1β（P＜0.01）、TNF-α（P＜0.01）、NF-κB（P＜0.01）显著升高,抗炎指标IL-4（P＜0.01）和IL-10（P＜0.01）水平显著降低;2 QBPF胶囊可改善COPD模型大鼠肺部炎症反应、肺泡结构破坏以及肺泡上皮细胞凋亡,显著降低COPD模型大鼠AMLI（P＜0.01）、血清炎性指标IL-1β（P＜0.01）、TNF-α（P＜0.05）、NF-κB（P＜0.01）及提高抗炎指标IL-4（P＜0.01）和IL-10（P＜0.05）表达;3与正常大鼠相比,COPD模型大鼠肺组织CYP1B1和HIF1α的mRNA及肺泡上皮细胞HIF1α蛋白表达显著升高,VEGFA的mRNA和肺泡上皮细胞ARNT蛋白表达显著降低;QBPF胶囊可降低COPD大鼠肺部CYP1B1、HIF1α的mRNA及肺泡上皮细胞HIF1α蛋白表达,提高VEGFA的mRNA表达和肺泡上皮细胞ARNT蛋白表达。第三部分QBPF胶囊含药血清可影响CYP1B1/HIF1α/VEGFA轴关键分子的表达,降低CSE诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡1 QBPF胶囊含药血清可提高肺泡上皮细胞A549的细胞活力,但12小时后各浓度含药血清干预的细胞活力开始下降。CSE可降低A549细胞活力,且60%CSE干预A549细胞24小时下的HIF1αmRNA水平（P＜0.05）达到高峰;2 60%CSE可提高肺泡上皮细胞A549细胞内ROS水平,并导致肺泡上皮细胞A549细胞凋亡;QBPF含药血清可降低60%CSE干预后A549细胞内ROS升高及A549细胞凋亡;3免疫荧光结果表明60%CSE可提高A549细胞HIF1α蛋白表达,降低ARNT蛋白表达;QBPF含药血清可降低CSE诱导的A549细胞HIF1α高表达,并提高ARNT蛋白表达;4 Western blot结果表明QBPF胶囊含药血清可降低CSE诱导的A549细胞HIF1α蛋白表达,并升高VEGFA和ARNT蛋白表达。HIF1α敲低后,HIF1α蛋白表达显著降低,且QBPF胶囊含药血清可降低CSE诱导的HIF1α和CYP1B1蛋白的表达,升高VEGFA和ARNT蛋白表达。此外,QBPF胶囊可降低60%CSE诱导A549细胞CYP1B1蛋白高表达（P＜0.05）,敲低HIF1α的表达后,CYP1B1仍具有相同的表达趋势（P＜0.05）。结论1 QBPF胶囊靶向COPD的DEGs可能是其防治COPD的潜在作用机制,其中HIF1α、VEGFA、CYP1B1可能是QBPF胶囊的主要靶点,HIF-1信号通路是其主要靶向通路;2 QBPF胶囊可改善COPD大鼠肺泡上皮细胞及CSE诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡,并降低A549细胞内ROS水平;3 COPD肺泡上皮细胞凋亡可能与CYP1B1、HIF1α升高和ARNT、VEGFA表达降低有关。QBPF胶囊可能通过降低HIF1α和CYP1B1的表达,升高ARNT和VEGFA的表达,降低COPD肺泡上皮细胞凋亡。