原发性肝癌的发生机制是国内外肿瘤研究的热点领域。近年来,有学者提出肿瘤细胞和干细胞都具有幼稚的细胞表型等多种相似性,并由此提出肿瘤的干细胞起源假说。随着研究的深入,已有多种方法应用于肿瘤组织中具有干细胞样特性的肿瘤细胞的分离纯化。利用干细胞对多种染料及异己物质具有排斥性的特异性功能标志,结合紫外光源激发的荧光激活细胞分选法(FACS),可得到低荧光并表现为边缘性聚集的边缘群细胞(Side Population,简称SP细胞)。该亚群细胞经较深入研究已被初步证实富集了具有干细胞样特性的细胞。目前这种分离富集干细胞样细胞的方法在多种组织的成体干细胞的分离中被成功应用,较原有的磁性活化分选和荧光活化分选更为高效。肿瘤细胞和干细胞在无限增殖,多向分化及自我更新机制等方面具有相似性。肿瘤异质性理论也被广泛证实。近年来在白血病、乳腺癌、中枢神经系统肿瘤等的研究中发现,在肿瘤组织中仅有极少数细胞具有无限增殖和致瘤的潜能。而大多数细胞只有有限的克隆扩增、形成肿瘤及自我更新潜能。干细胞样肿瘤细胞的不对称分裂产生细胞质、细胞器不均分布,分裂后形成两个不对称细胞的机制可能是形成肿瘤异质性的根本原因。原发性肝细胞癌是我国常见恶性肿瘤之一。对肝癌细胞中特殊细胞亚群的分离研究,可能是研究肝癌的发生、复发、转移、耐药形成的最佳途径。甲胎蛋白属胚胎类抗原,作为一种胚胎时期或病理状态的基因表达产物,它伴随着胚胎发育和细胞分裂旺盛的过程。此外,AFP还具有多种功能并在机体内发挥着多种重要的生理病理作用。免疫抑制方面,AFP能够明显抑制抗原提呈细胞如DC细胞的抗原提呈功能,降低NK细胞活性,抑制机体细胞免疫功能,还可以发挥运输、参与细胞再生、代谢调控等生理作用。早有多方研究证实肝癌组织AFP表达率明显高于癌旁。前期研究已初步证实肝癌边缘群细胞具有很强的克隆扩增、形成肿瘤及自我更新能力,具备干细胞样特征,并推测该亚群细胞应具备AFP高表达等幼稚表型,并因其分泌的AFP,使之更容易逃避机体的免疫监视,在肿瘤的发生、复发和转移中起重要作用。本实验研究拟通过紫外光激发的流式细胞荧光激活分选法获得肝癌细胞SP亚群,并用免疫细胞化学方法证实在肝癌细胞中AFP的表达存在明显差异,SP细胞AFP mRNA转录水平显著高于(Non-SP)细胞。以此进一步证实SP细胞中富含了表型幼稚,克隆扩增、形成肿瘤及自我更新能力强的,更为原始的干细胞样肿瘤细胞,而这部分细胞在整个肝癌细胞群中所占比例极小。并丰富了肝癌组织中是否存在肿瘤干细胞的实验依据,并进一步提示干细胞样肝癌细胞与肝癌的发生、复发、转移及耐药的关系。AFP在不同肝癌细胞亚群中的差异分布对阐明肝癌异质性提供了有力的实验依据,也有助于解释为什么近30%肝癌患者存在AFP阴性或低浓度表达的临床现象。目的:应用紫外光源激发的流式细胞荧光激活分选法分选肝癌细胞中边缘群及非边缘群两细胞亚群,采用免疫细胞化学方法观察蛋白质水平AFP的表达变化及含量,采用RT-PCR方法半定量分析AFP mRNA的转录水平。探讨AFP在不同肝癌细胞亚群中差异表达的意义。方法:1 SP细胞及No n-SP细胞的检测及分选制备Hoechst33342染色的肝癌单细胞悬液,对照组在此基础上加入钙离子通道拮抗剂阻断ABC转运蛋白家族ABCG2分子的主动外排作用。流式细胞仪检测肝癌细胞中Hoechst33342荧光,紫外激发光源,通过双色性反射滤镜和不同的组合滤片将肝癌细胞中荧光信号分为两个部分,以Hoechst Red为X轴,Hoechst Blue为Y轴作二维散点图,将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且对照组缺失的区域设定为SP细胞的“门”(gate),分选出SP细胞及Non-SP细胞。2 SP细胞及No n-SP细胞AFP免疫细胞化学分析SP细胞及Non-SP细胞爬片后,4%多聚甲醛常规固定。免疫细胞化学采用SP法,操作步骤参照试剂盒说明书。AFP单抗最适工作浓度1:100,DAB显色,胞质见棕黄色颗粒为阳性,PBS代替一抗作为阴性对照。应用Pro-Plus软件分析染色细胞平均光密度（IOD）比较两组细胞中AFP表达量。用SPSS 10.0统计软件包采用成组t检验对数据进行分析。3 SP细胞及Non-SP细胞AFP基因半定量RT-PCR分析分别提取边缘群细胞和非边缘群细胞的总RNA。反转录反应体系为20μl，采用随机引物。反应条件：70℃5 min，置于冰上，25℃5 min，25℃10 min，42℃60 min，70℃10 min，置于4℃。PCR反应中，以GAPDH为内参照。参照Gene Bank登录的人AFP及GADH基因碱基序列。应用Primer Premier5.0软件设计正、反义引物。PCR反应体系为25μl，反应步骤为：95℃5 min，95℃30S，56℃30 S，72℃90 S共22个循环，然后72℃，10min，终止于4℃。1.2%琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像仪上扫描后，以AFP mRNA光密度值与GAPDH mRNA光密度值的比值来比较两组细胞中AFPmRNA转录水平。统计分析利用SPSS 10.0统计软件包采用成组t检验方法对数据进行分析。结果：1 SP细胞及Non-SP细胞的检测及分选流式细胞仪双波长荧光分析结果显示MHCC97及HepG2细胞系中有边缘群细胞存在，加入钙离子通道拮抗剂后该亚群细胞明显减少，表明肝癌细胞系中SP细胞表型与细胞膜表面主动转运泵分子ABCG2的主动外排功能有关。SP亚群仅占两细胞系总体的极少数，分别为1.8%和2.9%。2 SP细胞及Non-SP细胞AFP免疫细胞化学分析SP细胞及Non-SP细胞分别爬片4小时后均伸展贴壁，免疫细胞化学分析发现SP细胞及Non-SP细胞胞浆内均可见棕黄色颗粒，应用Pro-Plus图像处理软件分析各亚群细胞吸光度值，再应用SPSS10.0软件进行方差齐性检验及成组t检验。表明MHCC97和HepG2细胞系边缘群和非边缘群细胞间AFP的表达在蛋白质水平有显著性差异。3 SP细胞及Non-SP细胞AFP基因半定量RT-PCR分析琼脂糖凝胶电泳结果显示在295bp和450bp处可见明显条带，分别为甲胎蛋白和内参照GAPDH的条带。对AFP mRNA光密度值与GAPDH mRNA光密度值的比值进行统计分析表明SP细胞组AFPmRNA转录水平明显高于Non-SP细胞组。mRNA转录水平明显高于Non-SP细胞组。结论：应用紫外光源激发的FACS富集了具有干细胞特征肿瘤细胞的SP细胞，并以代表细胞成熟程度以及具有免疫抑制等生理病理功能的AFP来分析肝癌细胞不同亚群的差异，探讨肿瘤的异质性，进一步阐明SP细胞富含了表型幼稚，克隆扩增、形成肿瘤及自我更新能力强的，更为原始的干细胞样肿瘤细胞，并提示其与肝癌的发生、复发、转移及耐药形成的关系。