炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD),发病率呈逐年上升趋势。其发病机制尚不十分明确,目前认为肠黏膜免疫异常、持续肠道感染、遗传和环境等因素共同参与IBD的发生发展。由于具有慢性及反复发作的特点,严重影响患者生活质量,给临床治疗带来极大的挑战。因此,进一步探讨和阐明IBD的发病机制对于寻找新的治疗方法具有重要的意义。肠黏膜免疫异常在IBD发病中发挥着重要作用,而CD4+T细胞是免疫系统中最重要的效能细胞。Th9细胞是新发现的一种CD4+T细胞亚群,主要通过分泌IL-9发挥促炎作用。Th9细胞的特异性转录因子为ETS(E26-transformation specific)家族转录因子富含嘌呤盒1(Purine-rich box1,PU.1)。TGF-β和IL-4是诱导Th9细胞产生和分化的关键细胞因子。体外在TGF-β和IL-4及IL-2等联合刺激下CD4 Na?ve T细胞可被诱导分化成为Th9细胞。Th9细胞参与多种自身免疫性疾病的发生,亦有少数报道发现其可促进IBD进程。多项研究发现,UC患者血清与结肠组织中Th9细胞与IL-9水平明显升高。在动物实验中也发现在实验性结肠炎小鼠的血清、肠系膜淋巴结、脾脏和结肠组织中Th9细胞的数量及IL-9表达均明显升高,说明Th9细胞与IL-9在结肠炎的发病中起到重要的作用。TL1A是新近发现的一种肿瘤坏死因子家族新成员。GWAS研究证实TNFSF15是IBD的易感基因。TL1A可为T淋巴细胞的激活提供协同刺激信号,刺激淋巴细胞增殖及细胞因子产生,进而在哮喘、类风湿性关节炎和IBD等多种疾病中发挥重要作用。研究发现,TL1A可通过与其受体结合协同刺激IL-12/IL-18,介导Th1型免疫反应促进T细胞和NK细胞的IFN-γ分泌,并且可作用于Th17细胞使其分泌IL-17增加。TL1A通过Th1、Th2和Th17细胞在肠道炎症中的作用已取得进展,但是仅有少数研究报道了在过敏性肺炎小鼠模型中TL1A可促进Th9细胞分化和IL-9生成。目前尚无TL1A与Th9细胞联合作用在IBD中的研究。TL1A是否通过Th9细胞及其分泌因子IL-9来调控肠道炎症尚不清楚。因此,本实验拟采用淋系细胞过表达TL1A的转基因小鼠及具有相同遗传背景的野生型小鼠为研究对象,建立DSS诱导的慢性实验性结肠炎模型,造模成功后给予小鼠腹腔注射IL-9抗体,并分离脾脏和肠系膜淋巴结单个核细胞,通过磁珠分选CD4 Na?ve T细胞,体外诱导分化成为Th9细胞,应用TL1A刺激,再分别加入TL1A抗体和IL-9抗体进行干预,在动物和细胞水平探讨TL1A在慢性实验性结肠炎中对Th9细胞和IL-9的作用与机制及IL-9抗体对慢性实验性结肠炎的治疗作用,以期为IBD的防治提供新的理论依据。具体实验分为以下三部分:第一部分:Th9细胞和IL-9在TL1A过表达慢性实验性结肠炎中的表达变化目的:探讨TL1A对慢性实验性结肠炎小鼠中Th9细胞及IL-9的作用与机制方法:1)PCR方法扩增TL1A DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测进行LCK-CD2-TL1A-GFP-transgenic小鼠的鉴定。2)通过饮用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)28天成功建立慢性实验性结肠炎模型:将Tg小鼠与有相同遗传背景的C57BL/6 WT小鼠(6~8周)随机分为:(1)Control/WT组;(2)DSS/WT组;(3)Control/Tg组;(4)DSS/Tg组,每组10只。小鼠分别于第1~5天、8~12天、15~19天和22~26天饮用2.5%DSS,其他时间饮用蒸馏水。共4个循环,每个循环的第1、3、5天进行疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分,第29天处死动物。3)炎症改变的评估:包括体重(Body weight,BW)改变、DAI、结肠长度、结肠形态学改变、病理组织学评分和MPO活性。4)免疫荧光共染方法检测CD4+IL-9+T细胞比例;流式细胞仪(Flow cytometry instrument,FCM)检测脾脏、MLN和肠黏膜固有层分离的单个核细胞中CD4+IL-9+T细胞比例;Real time PCR检测IL-9 mRNA在结肠组织中的表达;ELISA方法检测血清中和脾脏、MLN、肠黏膜固有层分离的单个核细胞培养上清液中IL-9的分泌。5)Real time PCR检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中TGF-β和IL-4 mRNA的表达;ELISA方法检测血液中和脾脏、MLN、肠黏膜固有层单个核细胞培养上清液中TGF-β和IL-4分泌。6)Western blot检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中TL1A和PU.1的蛋白定量表达;Real time PCR检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中TL1A mRNA和PU.1 mRNA的表达情况。结果:1)LCK-CD2-TL1A-GFP特定引物扩增小鼠DNA,凝胶成像显示Tg小鼠在192 bp处可见较强的荧光信号,据此进行转基因小鼠的鉴定。2)成功建立慢性结肠炎小鼠模型:DSS/WT组和DSS/Tg组小鼠在饮用2.5%DSS后,与Control/WT组和Control/Tg组小鼠相比体重明显下降,DAI评分明显升高,结肠黏膜充血、水肿、肠壁增厚,结肠大体形态学评分明显升高,结肠长度缩短;与DSS/WT组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠炎症更严重(P<0.05)。3)病理评分:DSS/WT组和DSS/Tg组小鼠出现了结肠黏膜缺损,腺体破坏或消失,杯状细胞减少,并可见黏膜、黏膜下层甚至肌层大量淋巴细胞浸润,与相应Control/WT组和Control/Tg组小鼠相比,DSS/WT组和DSS/Tg组小鼠病理评分明显增高(8.25±0.50 vs0.00±0.00,P<0.05)和(12.50±0.58 vs 0.00±0.00,P<0.05);与DSS/WT组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠病理评分增加更为明显(12.50±0.58 vs 8.25±0.50,P<0.05)。4)MPO活性:与Control/WT组小鼠相比,DSS/WT组小鼠结肠MPO活性明显升高(1.09±0.21 vs 0.43±0.11,P<0.05)。与Control/Tg组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠MPO活性明显增加(1.80±0.12 vs 0.60±0.07,P<0.05)。DSS/Tg组小鼠较DSS/WT组小鼠结肠MPO活性增加程度更大(1.80±0.12 vs 1.09±0.21,P<0.05)。5)免疫荧光方法检测结肠组织中CD4+IL-9+T细胞比例:与Control/WT组小鼠相比,DSS/WT组小鼠结肠组织中CD4+IL-9+平均光密度值显著升高(0.24±0.03 vs 0.09±0.01,P<0.05);同样,与Control/Tg组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠组织中CD4+IL-9+平均光密度值也显著升高(0.44±0.03 vs 0.10±0.01,P<0.05);与DSS/WT组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠组织中CD4+IL-9+平均光密度值升高程度更大(0.44±0.03 vs 0.24±0.03,P<0.05)。FCM检测脾脏、MLN和肠黏膜固有层单个核细胞CD4+IL-9+T细胞比例,均可见DSS/Tg组较DSS/WT组单个核细胞CD4+IL-9+T细胞比例增加(脾脏单个核细胞CD4+IL-9+T细胞比例:2.42%±0.37%vs 1.29%±0.24%,P<0.05;MLN单个核细胞CD4+IL-9+T细胞比例:2.53%±0.38%vs 1.76%±0.43%,P<0.05;肠黏膜固有层单个核细胞CD4+IL-9+T细胞比例:4.42%±0.45%vs 2.67%±0.58%,P<0.05)。Real time PCR检测结肠组织中IL-9 mRNA的表达:与Control/WT组小鼠相比,DSS/WT组小鼠结肠组织中IL-9 mRNA的表达显著升高(3.77±0.68 vs 1.03±0.23,P<0.05);同样,与Control/Tg组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠组织中IL-9 mRNA的表达也显著升高(6.19±0.74 vs 1.16±0.33,P<0.05);与DSS/WT组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠组织中IL-9 mRNA的表达升高程度更大(6.19±0.74 vs 3.77±0.68,P<0.05)。ELISA方法检测血清中和脾脏、MLN、肠黏膜固有层分离的单个核细胞培养上清液中IL-9分泌的水平,均显示与DSS/WT组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠IL-9分泌增加程度更大(血清IL-9水平:380.14pg/m L±15.30 pg/m L vs 253.72 pg/m L±19.97 pg/m L,P<0.05;脾脏单个核细胞培养上清液中IL-9分泌水平:385.02 pg/m L±20.02 pg/m L vs 228.61pg/m L±13.40 pg/m L,P<0.05;MLN单个核细胞培养上清液中IL-9分泌水平:401.74 pg/m L±13.18 pg/m L vs 241.93 pg/m L±17.19 pg/m L,P<0.05;肠黏膜固有层单个核细胞培养上清液中IL-9分泌水平:397.41 pg/m L±12.62pg/m L vs 248.43 pg/m L±20.62 pg/m L,P<0.05)。6)Real time PCR检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中TGF-β和IL-4 mRNA的表达:Control/WT组小鼠结肠组织中TGF-β和IL-4 mRNA分别为(1.02±0.20,1.01±0.17),而DSS/WT组小鼠结肠组织中TGF-β和IL-4 mRNA分别为(6.22±0.53,3.35±0.57),与Control/WT组相比表达明显升高(P<0.05)。Control/Tg组小鼠结肠组织中TGF-β和IL-4 mRNA分别为(1.16±0.24,1.29±0.33),而DSS/Tg组小鼠结肠组织中TGF-β和IL-4 mRNA分别为(15.06±1.63,4.80±0.89),与Control/Tg组相比表达明显升高(P<0.05)。与DSS/WT组小鼠结肠组织中TGF-β和IL-4 mRNA表达(6.22±0.53,3.35±0.57)相比,DSS/Tg组小鼠表达(15.06±1.63,4.80±0.89)进一步升高(P<0.05);ELISA方法分别检测脾脏、MLN和肠黏膜固有层单个核细胞培养上清液中TGF-β和IL-4分泌:DSS/Tg组TGF-β和IL-4分泌水平较DSS/WT组明显升高(脾脏单个核细胞培养上清液中TGF-β分泌水平:514.69 pg/m L±47.13pg/m L vs 280.66 pg/m L±26.84 pg/m L,P<0.05;脾脏单个核细胞培养上清液中IL-4分泌水平:160.49 pg/m L±9.20 pg/m L vs 117.99 pg/m L±8.87pg/m L,P<0.05;MLN单个核细胞培养上清液中TGF-β分泌水平:558.93pg/m L±30.10 pg/m L vs 305.71 pg/m L±29.32 pg/m L,P<0.05;MLN单个核细胞培养上清液中IL-4分泌水平:169.39 pg/m L±10.42 pg/m L vs 115.38pg/m L±5.80 pg/m L,P<0.05;肠黏膜固有层单个核细胞培养上清液中TGF-β分泌水平:622.93 pg/m L±34.76 pg/m L vs 319.62 pg/m L±39.45 pg/m L,P<0.05;肠黏膜固有层单个核细胞培养上清液中IL-4分泌水平:175.92pg/m L±8.27 pg/m L vs 123.83 pg/m L±6.15 pg/m L,P<0.05)。7)Real time PCR检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中TL1A和PU.1 mRNA的表达:Control/WT组小鼠结肠组织TL1A和PU.1 mRNA分别为(1.01±0.14,1.03±0.26),而DSS/WT组小鼠结肠组织TL1A和PU.1 mRNA分别为(9.19±1.24,2.68±0.46),与Control/WT组相比明显升高(P<0.05);Control/Tg组小鼠结肠组织TL1A和PU.1 mRNA分别为(1.21±0.16,1.20±0.18),而DSS/Tg组小鼠结肠组织TL1A和PU.1 mRNA分别为(12.62±2.01,4.90±0.87),与Control/Tg组相比明显升高(P<0.05);与DSS/WT组小鼠小鼠结肠组织TL1A和PU.1 mRNA(9.19±1.24,2.68±0.46)相比,DSS/Tg组小鼠(12.62±2.01,4.90±0.87)进一步升高(P<0.05)。8)Western blot检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中TL1A和PU.1的蛋白表达:Control/WT组小鼠结肠组织TL1A和PU.1蛋白表达分别为(0.16±0.06,0.16±0.04),而DSS/WT组小鼠分别为(0.49±0.10,0.54±0.06),与Control/WT组相比明显升高(P<0.05);Control/Tg组小鼠结肠组织TL1A和PU.1蛋白表达分别为(0.20±0.09,0.20±0.04),而DSS/Tg组小鼠分别为(0.78±0.11,0.76±0.07),与Control/Tg组相比明显升高(P<0.05);与DSS/WT组小鼠小鼠结肠组织TL1A和PU.1蛋白表达(0.49±0.10,0.54±0.06)相比,DSS/Tg组小鼠(0.78±0.11,0.76±0.07)进一步升高(P<0.05)。第二部分:TL1A对Th9细胞的诱导分化作用与机制研究目的:应用CD4 Na?ve T细胞诱导分化为Th9细胞,应用TL1A刺激,再分别加入TL1A抗体和IL-9抗体进行干预,探讨TL1A对Th9细胞的诱导分化作用。方法:1)应用CD4 Na?ve T细胞磁珠分选分别从TL1A过表达Tg小鼠和WT小鼠脾脏与MLN的单个核细胞中阴性分选CD4 Na?ve T细胞,应用FCM鉴定其中CD3~+CD4~+CD44-CD62L+细胞(即CD4 Na?ve T细胞)分选率。2)诱导分化Th9细胞成功后,应用FCM分别检测脾脏和MLN中提取并诱导分化的Th9细胞中CD4+IL-9+T细胞比例。3)在诱导分化Th9细胞过程中加入100 ng/m L TL1A,应用流式细胞仪检测CD4+IL-9+T细胞比例、ELISA方法检测各组培养液上清IL-9分泌水平以及Western blot检测Th9细胞中PU.1的蛋白表达。4)在诱导分化Th9细胞过程中进一步加入4 ug/m L TL1A抗体,应用流式细胞仪检测CD4+IL-9+T细胞比例、ELISA方法检测各组培养液上清IL-9分泌水平以及Western blot检测Th9细胞中PU.1的蛋白表达。5)在诱导分化Th9细胞过程中进一步加入50 ng/m L IL-9抗体,应用流式细胞仪检测CD4+IL-9+T细胞比例、ELISA方法检测各组培养液上清IL-9分泌水平以及Western blot检测Th9细胞中PU.1的蛋白表达。结果:1)应用CD4 Na?ve T细胞磁珠分选试剂盒分别从脾脏和MLN的单个核细胞中阴性分选得到CD4 Na?ve T细胞后,FCM鉴定其中CD3~+CD4~+CD44-CD62L+细胞(即CD4 Na?ve T细胞)分选率,脾脏和MLN分选纯度分别为(90.18%±2.62%)和(92.12%±2.82%),能够满足后续实验要求。2)应用FCM分别检测Th9细胞、脾脏和MLN单个核细胞中CD4+IL-9+T细胞比例:与脾脏单个核细胞相比,脾脏中提取并诱导分化的Th9细胞CD4+IL-9+T细胞比例明显升高(WT组:20.93%±3.60%vs 0.28%±0.10%,P<0.05;Tg组:31.40%±3.66%vs 0.42%±0.10%,P<0.05),且Th9细胞/Tg较Th9细胞/WT组中CD4+IL-9+T细胞比例更高(P<0.05)。同样与MLN单个核细胞相比,MLN中提取并诱导分化的Th9细胞CD4+IL-9+T细胞比例明显升高(WT组:20.50%±3.62%vs 0.31%±0.12%,P<0.05;Tg组:30.53%±3.80%vs 0.42%±0.13%,P<0.05),且Th9细胞/Tg较Th9细胞/WT组中CD4+IL-9+T细胞比例更高(P<0.05)。3)在诱导分化Th9细胞过程中加入TL1A,检测CD4+IL-9+T细胞比例、IL-9分泌水平以及PU.1的蛋白表达:脾脏提取并诱导分化的Th9细胞中,TL1A/WT组(CD4+IL-9+T细胞:30.63%±2.32%vs 21.07%±2.35%,P<0.05;IL-9:3867.63 pg/m L±88.11pg/m L vs 2464.15 pg/m L±122.63 pg/m L,P<0.05;PU.1:1.25±0.08 vs 0.95±0.06,P<0.05)和TL1A/Tg组(CD4+IL-9+T细胞:37.63%±2.26%vs29.90%±2.33%,P<0.05;IL-9:4221.90 pg/m L±81.11 pg/m L vs 2855.90pg/m L±128.59 pg/m L,P<0.05;PU.1:1.42±0.07 vs 1.18±0.06,P<0.05)的CD4+IL-9+T细胞比例、IL-9分泌水平以及PU.1蛋白表达均比各自Control组明显上升,且TL1A/Tg组较TL1A/WT组升高更为明显(P<0.05)。同样MLN提取并诱导分化的Th9细胞中,和各自相应的Control组相比,TL1A/WT组(CD4+IL-9+T细胞:29.80%±2.3%vs 24.60%±1.67%,P<0.05;IL-9:3939.17 pg/m L±166.15 pg/m L vs 2603.82 pg/m L±98.20 pg/m L,P<0.05;PU.1:1.23±0.06 vs 0.93±0.06,P<0.05)和TL1A/Tg组(CD4+IL-9+T细胞:42.67%±2.56%vs 31.40%±2.75%,P<0.05;IL-9:4337.73pg/m L±161.69 pg/m L vs 3142.04 pg/m L±153.75 pg/m L,P<0.05;PU.1:1.41±0.08 vs 1.22±0.08,P<0.05)的CD4+IL-9+T细胞比例、IL-9分泌水平以及PU.1蛋白表达均明显上升,且TL1A/Tg组较TL1A/WT组升高更为明显(P<0.05)。4)在诱导分化Th9细胞过程中加入TL1A抗体,检测CD4+IL-9+T细胞比例、IL-9分泌水平以及PU.1的蛋白表达:脾脏提取并诱导分化的Th9细胞中,TL1A Ab/WT组(CD4+IL-9+T细胞:18.30%±1.51%vs30.63%±2.32%,P<0.05;IL-9:2556.13 pg/m L±83.65 pg/m L;PU.1:0.63±0.07 vs 1.25±0.08,P<0.05)和TL1A Ab/Tg组(CD4+IL-9+T细胞:23.67%±2.06%vs 37.63%±2.26%,P<0.05;IL-9:2556.13 pg/m L±83.65 pg/m L vs3867.63 pg/m L±88.11 pg/m L,P<0.05;PU.1:0.85±0.07 vs 1.42±0.07,P<0.05)的CD4+IL-9+T细胞比例、IL-9分泌水平以及PU.1蛋白表达均比各自TL1A组明显下降,且TL1A Ab/WT组较TL1A Ab/Tg组下降更为明显(P<0.05)。同样MLN提取并诱导分化的Th9细胞中,和各自相应的TL1A组相比,TL1A Ab/WT组(CD4+IL-9+T细胞:17.33%±1.96%vs 29.80%±2.30%,P<0.05;IL-9:2576.57 pg/m L±53.10 pg/m L vs 3939.17 pg/m L±166.15pg/m L,P<0.05;PU.1:0.63±0.09 vs 1.23±0.06,P<0.05)和TL1A Ab/Tg组(CD4+IL-9+T细胞:29.50%±2.01%vs 42.27%±2.56%,P<0.05;IL-9:3111.39 pg/m L±62.44 pg/m L vs 4337.73 pg/m L±161.69 pg/m L,P<0.05;PU.1:0.92±0.10 vs 1.41±0.08,P<0.05)的CD4+IL-9+T细胞比例、IL-9分泌水平以及PU.1蛋白表达均明显下降(P<0.05),且TL1A Ab/WT组较TL1A Ab/Tg组下降更为明显(P<0.05)。5)在诱导分化Th9细胞过程中加入IL-9抗体,检测CD4+IL-9+T细胞比例、IL-9分泌水平以及PU.1的蛋白表达:脾脏提取并诱导分化的Th9细胞中,IL-9 Ab/WT组(CD4+IL-9+T细胞:23.50%±1.93%vs 30.63%±2.32%,P<0.05;IL-9:2218.88pg/m L±90.83 pg/m L vs 3867.63 pg/m L±88.11 pg/m L,P<0.05;PU.1:0.76±0.08 vs 1.25±0.08,P<0.05)和IL-9 Ab/Tg组(CD4+IL-9+T细胞:26.77%±1.90%vs 37.63%±2.26%,P<0.05;IL-9:2669.20 pg/m L±100.65 pg/m L vs4221.90 pg/m L±81.11 pg/m L,P<0.05;PU.1:0.94±0.06 vs 1.42±0.07,P<0.05)的CD4+IL-9+T细胞比例、IL-9分泌水平以及PU.1蛋白表达均比各自TL1A组明显下降(P<0.05),且IL-9 Ab/WT组较IL-9 Ab/Tg组下降更为明显(P<0.05)。同样MLN提取并诱导分化的Th9细胞中,和各自相应的TL1A组相比,IL-9 Ab/WT组(CD4+IL-9+T细胞:24.70%±2.10%vs29.80%±2.30%,P<0.05;IL-9:2215.48 pg/m L±129.40 pg/m L vs 3939.17pg/m L±166.15 pg/m L,P<0.05;PU.1:0.66±0.07 vs 1.23±0.06,P<0.05)和IL-9 Ab/Tg组(CD4+IL-9+T细胞:30.20%±2.40%vs 42.27%±2.56%,P<0.05;IL-9:2719.64 pg/m L±61.32 pg/m L vs 4337.73 pg/m L±161.69 pg/m L,P<0.05;PU.1:0.88±0.08 vs 1.41±0.08,P<0.05)的CD4+IL-9+T细胞比例、IL-9分泌水平以及PU.1蛋白表达均明显下降(P<0.05),且IL-9 Ab/WT组较IL-9 Ab/Tg组下降更为明显(P<0.05)。第三部分:IL-9抗体对TL1A过表达慢性实验性结肠炎的治疗作用目的:研究IL-9抗体对TL1A过表达慢性实验性结肠炎的影响,结合第一、二部分结果进一步证实TL1A对Th9细胞及IL-9的作用,以期为探寻IBD新的治疗方法提供理论依据。方法:1)将Tg C57BL/6小鼠与有相同遗传背景的WT小鼠(体重20~22g,8~10周)随机分为:(1)Control/WT组;(2)DSS/WT组;(3)Isotype Ab/WT组;(4)IL-9 Ab/WT组;(5)Control/Tg;(6)DSS/Tg组;(7)Isotype Ab/Tg组;(8)IL-9 Ab/Tg组,每组10只。Control组饮用蒸馏水;DSS组、IL-9 Ab组和Isotype Ab组小鼠饮用2.5%DSS的时间段为分别为1~5天、8~12天、15~19天和22~26天,27和28天及其他时间饮蒸馏水;IL-9 Ab组和Isotype Ab组第15天开始分别给予IL-9抗体和同型免疫球蛋白G腹腔注射,抗体剂量为100 ug/只,隔日1次。分别于每个循环的第1、3、5天进行DAI评分,第29天处死动物。2)炎症改变的评估:包括体重(Body weight,BW)改变、疾病活动指数(Disease activity index,DAI)、结肠长度、结肠形态学改变、病理评分和MPO活性。3)免疫荧光共染方法检测结肠组织中CD4+IL-9+T细胞比例;FCM检测脾脏、MLN、肠黏膜固有层分离的单个核细胞中CD4+IL-9+T细胞比例;ELISA方法检测血清中和脾脏、MLN、肠黏膜固有层分离的单个核细胞培养上清液中IL-9的分泌;Real time PCR检测IL-9 mRNA在结肠组织中的表达。4)Real time PCR检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中PU.1 mRNA的表达情况;Western blot检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中PU.1的蛋白表达。结果:1)给予IL-9抗体治疗后,与相应DSS/WT组和DSS/Tg组小鼠相比,IL-9 Ab/WT组和IL-9 Ab/Tg组小鼠体重明显回升,DAI评分和结肠大体形态学评分均明显下降,结肠长度更长;与DSS/Tg组小鼠相比,DSS/WT组小鼠缓解更明显。2)病理评分:给予IL-9抗体治疗后,IL-9Ab/WT组小鼠结肠炎细胞浸润明显减少,结构破坏减轻,黏膜得到修复,病理评分明显低于DSS/WT组小鼠(3.83±0.98 vs 11.00±0.63,P<0.05);与DSS/WT组小鼠相比,Isotype Ab/WT组小鼠结肠组织形态学评分(10.33±0.52 vs 11.00±0.63,P>0.05)无明显变化。同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠结肠组织病理评分明显低于DSS/Tg组小鼠(6.33±0.82 vs 13.67±1.03,P<0.05);与DSS/Tg组小鼠相比,Isotype Ab/Tg组小鼠结肠组织病理评分(12.83±1.17 vs 13.67±1.03,P>0.05)无明显区别。同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组小鼠病理评分更低(3.83±0.98 vs 6.33±0.82,P<0.05)。3)MPO活性:给予IL-9抗体治疗后,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织MPO活性与DSS/WT组小鼠相比明显下降(0.13±0.02 vs 0.97±0.13,P<0.05);而Isotype Ab/WT组小鼠结肠组织MPO活性与DSS/WT组小鼠相比无明显变化(0.80±0.26 vs 0.97±0.13,P>0.05)。同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠结肠组织MPO活性与DSS/Tg组小鼠相比明显下降(0.42±0.07 vs 1.94±0.12,P<0.05);而Isotype Ab/Tg组小鼠结肠组小鼠结肠组织MPO活性与DSS/Tg组小鼠相比无明显变化(1.89±0.36 vs 1.94±0.12,P>0.05)。同时,与IL-9Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织MPO活性更低(0.13±0.02 vs0.42±0.07,P<0.05)。4)CD4和IL-9免疫荧光共染方法检测结肠组织中CD4+IL-9+T细胞的比例:给予IL-9抗体治疗后,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织CD4+IL-9+T细胞的比例与DSS/WT组小鼠相比明显下降(0.20±0.04vs 0.32±0.03,P<0.05);而Isotype Ab/WT组小鼠结肠组织CD4+IL-9+T细胞的比例与DSS/WT组小鼠相比无明显变化(0.33±0.02 vs 0.32±0.03,P>0.05)。同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠结肠组织CD4+IL-9+T细胞的比例与DSS/Tg组小鼠相比明显下降(0.29±0.02 vs 0.48±0.02,P<0.05);而Isotype Ab/Tg组小鼠结肠组小鼠结肠CD4+IL-9+T细胞的比例与DSS/Tg组小鼠相比无明显变化(0.44±0.04 vs 0.48±0.02,P>0.05)。同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织CD4+IL-9+T细胞的比例更低(0.20±0.04vs 0.29±0.02,P<0.05);FCM检测脾脏、MLN和肠黏膜固有层单个核细胞中CD4+IL-9+T细胞比例:给予IL-9抗体治疗后,IL-9 Ab/WT组小鼠脾脏单个核细胞中CD4+IL-9+T细胞比例与DSS/WT组小鼠相比明显下降(0.60%±0.03%vs 1.19%±0.12%,P<0.05);而Isotype Ab/WT组小鼠CD4+IL-9+T细胞比例与DSS/WT组小鼠相比无明显变化(1.21%±0.17%vs1.19%±0.12%,P>0.05);同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠CD4+IL-9+T细胞比例与DSS/Tg组小鼠相比明显下降(0.87%±0.08%vs 2.26%±0.19%,P<0.05);而Isotype Ab/Tg组小鼠CD4+IL-9+T细胞比例与DSS/Tg组小鼠相比无明显变化(2.22%±0.24%vs 2.26%±0.19%,P>0.05);同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组小鼠CD4+IL-9+T细胞比例更低(0.60%±0.03%vs0.87%±0.08%,P<0.05)。同样,在MLN和肠黏膜固有层单个核细胞中CD4+IL-9+T细胞比例与脾脏中单个核细胞中CD4+IL-9+T细胞比例变化一致。Real time PCR检测结肠组织中IL-9 mRNA的表达:给予IL-9抗体治疗后,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织IL-9 mRNA表达与DSS/WT组小鼠相比明显下降(2.53±0.38 vs 3.56±0.78,P<0.05);而Isotype Ab/WT组小鼠结肠组织IL-9 mRNA表达与DSS/WT组小鼠相比无明显变化(3.60±0.74vs 3.56±0.78,P>0.05)。同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠结肠组织IL-9 mRNA表达与DSS/Tg组小鼠相比明显下降(5.18±0.64 vs 6.32±0.74,P<0.05);而Isotype Ab/Tg组小鼠结肠组小鼠结肠IL-9 mRNA表达与DSS/Tg组小鼠相比无明显变化(6.35±0.68 vs 6.32±0.74,P>0.05)。同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织IL-9 mRNA表达更低(2.53±0.38 vs5.18±0.64,P<0.05)。ELISA方法检测血清中和脾脏、MLN、肠黏膜固有层分离的单个核细胞培养上清液中IL-9分泌水平:给予IL-9抗体治疗后,在血清中检测IL-9水平,可见IL-9 Ab/WT组IL-9分泌与DSS/WT组小鼠相比明显下降(119.12 pg/m L±6.90 pg/m L vs 261.05 pg/m L±20.30 pg/m L,P<0.05);而Isotype Ab/WT组IL-9分泌与DSS/WT组小鼠相比无明显变化(280.82 pg/m L±17.30 pg/m L vs 261.05 pg/m L±20.30 pg/m L,P>0.05);同样,IL-9 Ab/Tg组IL-9分泌与DSS/Tg组小鼠相比明显下降(278.59pg/m L±14.11 pg/m L vs 389.26 pg/m L±15.02 pg/m L,P<0.05);而Isotype Ab/Tg组IL-9分泌与DSS/Tg组相比无明显变化(381.92 pg/m L±12.34pg/m L vs 389.26 pg/m L±15.02 pg/m L,P>0.05)。同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组IL-9分泌更低(119.12 pg/m L±6.90 pg/m L vs 278.59pg/m L±14.11 pg/m L,P<0.05)。在脾脏、MLN和肠黏膜固有层分离的单个核细胞培养上清液中检测IL-9分泌水平可得到一致结论。5)Real time PCR检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中PU.1 mRNA的表达:给予IL-9抗体治疗后,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织PU.1 mRNA表达与DSS/WT组小鼠相比明显下降(1.98±0.34 vs 2.66±0.43,P<0.05);而Isotype Ab/WT组小鼠结肠组织PU.1 mRNA表达与DSS/WT组小鼠相比无明显变化(2.69±0.44 vs 2.66±0.43,P>0.05)。同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠结肠组织PU.1 mRNA表达与DSS/Tg组小鼠相比明显下降(2.81±0.59 vs 4.75±0.86,P<0.05);而Isotype Ab/Tg组小鼠结肠组小鼠结肠PU.1 mRNA表达与DSS/Tg组小鼠相比无明显变化(4.80±0.86 vs 4.75±0.86,P>0.05)。同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织PU.1 mRNA表达更低(1.98±0.34 vs 2.81±0.59,P<0.05);Western blot检测慢性实验性结肠炎小鼠结肠组织中PU.1的蛋白表达:给予IL-9抗体治疗后,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织PU.1蛋白表达与DSS/WT组小鼠相比明显下降(0.24±0.05 vs0.50±0.06,P<0.05);而Isotype Ab/WT组小鼠结肠组织PU.1蛋白表达与DSS/WT组小鼠相比无明显变化(0.51±0.06 vs 0.50±0.06,P>0.05)。同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠结肠组织PU.1蛋白表达与DSS/Tg组小鼠相比明显下降(0.48±0.05 vs 0.71±0.07,P<0.05);而Isotype Ab/Tg组小鼠结肠组小鼠结肠PU.1蛋白表达与DSS/Tg组小鼠相比无明显变化(0.68±0.06 vs0.71±0.07,P>0.05)。同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织PU.1蛋白表达更低(0.24±0.05 vs 0.48±0.05,P<0.05)。结论:1在DSS诱导的慢性实验性结肠炎中Th9细胞分化及IL-9的表达明显增加,TL1A转基因组增加更为明显,提示TL1A在慢性实验性结肠炎发病过程中促进了Th9细胞的分化及IL-9的生成,进而促进慢性实验性结肠炎的发生。2 TL1A促进了Th9细胞的诱导分化;TL1A通过上调PU.1的表达,促进Th9细胞诱导分化及IL-9分泌,因此,TL1A调控PU.1的表达是其诱导Th9细胞分化及IL-9分泌的机制之一。3 IL-9抗体对慢性实验性结肠炎具有治疗作用,IL-9抗体在直接拮抗IL-9的同时,能够下调PU.1的表达,减少Th9细胞的分化,进一步导致IL-9生成减少。