研究背景非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)仅次于病毒性肝炎的第二大肝病,已经成为我国常见的慢性肝病之一,其发病率大约为14～20%,严重危害人民生活健康。NAFLD以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝及其演变的脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。研究发现遗传易感性、胰岛素抵抗、肠源性内毒素血症以及PPARα与其发病关系密切。其中胰岛素抵抗是关键的始动因素,肠源性内毒素血症以及PPARα的表达下调作为“二次打击”,最终造成脂肪在肝脏大量蓄积出现脂肪肝的病理改变。祖国医学虽无“脂肪肝”的病名,《内经》中有“肝满”、“肝胀”、“胁痛”等记载,符合脂肪肝的临床表现。其病位在肝,与胆、脾、胃、肾均有关。多因过食肥甘,或饮酒过度,或感受湿热疫毒,或情志失调,或久病体虚,导致痰湿瘀阻互结,痹阻肝脏脉络而成。红曲性味甘、温、无毒,归肝、脾胃、大肠经,具有健脾消食、活血化淤之功效;现代药理研究发现其有效成份之一的洛伐他汀,具有较为理想的抗炎、降胆固醇的功效,已在临床广泛利用。因此,本课题组推测,红曲可能具有较好的抗NAFLD的效应,对红曲抗NAFLD的分子机制深入研究,是中药创新的切入点。本项目在中医药理论指导下,结合现代医学研究进展,通过高脂饮食诱导胰岛素抵抗NAFLD大鼠模型,继而予以不同剂量红曲干预8周,以绞股蓝为阳性对照组,采用HE染色、全自动生化分析、胰岛素-血糖钳夹、RT-PCR、Western-blot、ELISA等实验技术检测各组大鼠血脂、肝脏生化、胰岛素抵抗以及TNF-α、IL-6、IL-10、PPARα等指标的变化,探讨红曲治疗NAFLD的效应及其作用机制,为提高中医药防治水平提供实验依据。目的观察红曲对胰岛素抵抗,肝脏生化、血脂改变以及TNF-α、IL-6、IL-10、PPARα等指标的影响,探讨胰岛素抵抗、肠源性内毒素血症以及过氧化物增殖激活受体在大鼠NAFLD发病中的作用及红曲拮抗NAFLD的分子机制。方法:48只SD大鼠,雌雄各半,适应性喂养1周后,按体重随机分为6组,正常组、模型组、绞股蓝组、红曲低剂量组、红曲中剂量组、红曲高剂量组,每组8只。正常组予普通饲料,同步饲养8周;其余各组予高脂饲养喂养,并分别予等剂量生理盐水、绞股蓝水溶液、低、中、高剂量红曲水溶液灌胃,连续8周。第9周,处死所有大鼠,取肝脏及腹主动脉血备用。HE染色、光镜下对各组大鼠肝脏组织病理学评分,从形态学上分析NAFLD大鼠及红曲干预后肝脏组织结构的变化;全自动生化分析仪分析血清ALT、AST、及血脂变化;放免法检测肝纤四项;正常葡萄糖-高胰岛素钳夹技术评估胰岛素抵抗变化,以观察红曲改善胰岛素抵抗的效应;ELSIA及RT-PCR技术检测各组大鼠TNF-α、IL-6、IL-10水平变化,分析红曲对TNF-α、IL-6、IL-10的影响,以观察红曲对上述细胞因子的调控机制;Western-blot、RT-PCR技术检测各组大鼠肝脏PPARαmRNA和蛋白水平变化,从蛋白表达水平和从基因转录水平分析NAFLD大鼠肝脏PPARα的情况及红曲对其进行治疗后的肝脏PPARα的影响。统计学处理:计量资料用平均值±标准差((?)±s)表示,数据处理采用SPSS11.5统计软件包进行单因素方差分析(One-way ANOVA);计数资料采用秩和检验。P＜0.05有统计学意义。结果1红曲对NAFLD大鼠的症状、体征的影响正常组大鼠表现为体重自然增加,反应灵活,活动敏捷,皮毛密集而有光泽,紧贴皮肤,鼻、唇湿润清洁,眼睛明亮,大便正常,在饲养过程中未发现死亡。模型组动物表现饮食减少,生长缓慢,皮毛干枯、蓬松且易脱落,活动迟缓,反应迟钝,眼睛、鼻、唇、耳、尾部色淡少泽。各治疗组行为学表现、体重和营养状况等方面与模型组比较有一定改善,无统计学意义P=0.487。以红曲高剂量组改善情况为佳。2红曲对NAFLD大鼠肝组织形态学的影响从光镜下肝脏病理组织学变化看,模型组大鼠成模率100%,肝脏全小叶脂肪变性,大囊泡性,并有大囊泡融合形成脂囊。基本存在小叶内炎症,以单核细胞、淋巴细胞浸润为主,并可见点状坏死、灶状坏死、碎屑样坏死。绞股蓝组可见部分肝脂肪细胞变性、仅见少许炎性细胞浸润,无汇管区纤维组织增生;红曲高剂量组仅见少许肝细胞脂肪变性,肝小叶内仅有少量炎细胞浸润,无灶状及碎屑样坏死,汇管区纤维组织增生、淋巴细胞浸润不明显。红曲低、中剂量组脂肪变性及炎症程度介于模型组和红曲高剂量组之间。3红曲对NAFLD大鼠肝功能、血脂的影响①肝脏酶学变化提示:模型组与各组比较,大鼠存在肝脏酶学异常改变(P=0.000),以ALT、AST升高为主,ALT/AST＜1,这表明存在脂肪性肝炎肝细胞坏死的生化改变;予红曲、绞股蓝干预后,ALT、AST呈下降改变。红曲各治疗组与绞股蓝组之间比较,无统计学差异(P=0.337)。②血脂变化表明:模型组与正常组比较,大鼠血脂紊乱,存在总胆固醇以及低密度脂蛋白增高、高密度脂蛋白降低变化,有统计学差异(P=0.001);经红曲干预后,大鼠血脂紊乱无改善;但绞股蓝组出现TG、LDL-C下降以及HDL-C上调的趋势,红曲高剂量组与绞股蓝组比较在CHOL及HDL-C,有统计学差异(P=0.013,P=0.006)。4.红曲对NAFLD大鼠肝纤维化的影响NAFLD大鼠肝纤四项变化提示,模型组LN、HA、PCⅢ、CⅣ均呈上升趋势;除红曲低剂量组肝纤四项变化呈下降趋势;其余各组肝纤四项变化不明显。模型组与红曲各剂量组、绞股蓝组比较,无统计学差异(P=0.057);红曲无改善大鼠肝纤维化的作用。5红曲对NAFLD大鼠胰岛素抵抗的影响实验前(即钳夹开始前60min)各组大鼠血糖差别较大,模型组大鼠空腹血糖与正常对照组相比升高(P=0.016),表明NAFLD大鼠存在血糖代谢的障碍。实验开始60min后(即钳夹开始0min)各组血糖均达到稳态(5.3mmol/l),表明葡萄糖钳夹形成。实验过程中各组血糖保持稳定,符合高胰岛素葡萄糖钳夹实验要求。高脂饮食组(包括模型组及各治疗组)和正常对照组的空腹血糖水平相近。空腹胰岛素水平高脂饮食组高于正常对照组(P=0.030)。通过钳夹实验发现高脂饮食大鼠的GIR低于普通饮食,说明高脂饮食大鼠对胰岛素敏感性降低,存在胰岛素抵抗。予红曲治疗后,空腹胰岛素水平呈下降趋势,表明红曲具有一定改善胰岛素抵抗的作用。6红曲对NAFLD大鼠肠源性内毒素血症的影响NAFLD大鼠炎性细胞因子变化结果提示。大鼠TNF-α(pg/ml):正常组38.34±4.57、模型组50.05±3.74、绞股蓝组34.99±7.99、红曲低、中、高剂量组分别为49.40±6.61、44.90±12.04和35.68±7.29,模型组与各治疗组比较,有统计学意义(P=0.000);红曲高剂量组与绞股蓝组比较,无统计学意义(P＞0.05);红曲高剂量组与低、中剂量组比较,有统计学意义(P＜0.001);大鼠IL-6(pg/ml):正常组26.65±3.67、模型组34.35±2.36、绞股蓝组30.79±6.50、红曲低、中、高剂量组分别为34.89±7.27、30.75±1.81和28.61±9.51,模型组与各治疗组比较,无统计学意义(P=0.879);红曲高剂量组与低、中剂量组比较,无统计学意义(P=0.929);红曲高剂量组与绞股蓝组比较,无统计学意义(P=1.000)。大鼠IL-10(pg/ml):正常组为36.87±4.58、模型组20.20±5.79、绞股蓝组20.61±7.44、红曲低、中、高剂量组分别为27.65±4.28、25.18±9.82和24.00±11.15,模型组与各治疗组比较,无统计学意义(P=0.326);红曲高剂量组与低、中剂量组比较,有统计学意义(P=0.344);红曲高剂量组与绞股蓝组比较,无统计学意义(P=0.388)。②大鼠TNF-αmRNA表达:正常组0.51±0.50、模型组1.21±0.55、绞股蓝组0.54±0.24、红曲低、中、高剂量组分别为0.63±0.28、0.65±0.50、0.73±0.39,模型组与各治疗组比较,无统计学意义(P=0.143);红曲高剂量组与低、中剂量组比较,无统计学意义(P=0.546);红曲高剂量组与绞股蓝组比较,无统计学意义(P=0.774)。大鼠IL-6mRNA表达:正常组0.29±0.16、模型组0.53±0.18、绞股蓝组0.41±0.22、红曲低、中、高剂量组分别为0.29±0.27、0.50±0.18和0.50±0.14,模型组与各治疗组比较,无统计学意义(P=0.130);红曲高剂量组与低、中剂量组比较,无统计学意义(P=0.390);红曲高剂量组与绞股蓝组比较,无统计学意义(P=0.433)。大鼠IL-10mRNA表达:正常组分别为0.55±0.07、模型组0.32±0.16、绞股蓝组0.40±0.13、红曲低、中、高剂量组分别为0.40±0.13、0.32±0.12和0.33±0.12,模型组与各治疗组比较,无统计学意义(P=0.399);红曲高剂量组与低、中剂量组比较,无统计学意义(P=0.942);红曲高剂量组与绞股蓝组比较,无统计学意义(P=0.809)。7红曲对NAFLD大鼠肝脏PPARα的影响肝脏PPARαmRNA及蛋白质定性及半定量表达。大鼠PPARαmRNA:正常组1.13±0.01、绞股蓝组1.04±0.01、模型组0.56±0.01、红曲低、中、高剂量组分别为1.03±0.01、1.06±0.01和1.07±0.02,模型组与各治疗组比较,有统计学意义(P=0.000);红曲高剂量组与绞股蓝组比较,无统计学意义(P=0.073);红曲高剂量与低剂量组比较,有统计学意义(P=0.013);红曲高剂量与中剂量组比较,无统计学意义(P=0.275);大鼠PPARα蛋白质:正常组1.01±0.04、绞股蓝组1.42±0.04、模型组0.76±0.01、红曲低、中、高剂量组分别为1.36±0.02、1.42±0.06和1.43±0.07,模型组与各治疗组比较,有统计学意义(P=0.000);红曲高剂量组与绞股蓝组比较,无统计学意义(P=0.965);红曲高剂量与低剂量组比较,无统计学意义(P=0.276);红曲高剂量与中剂量组比较,无统计学意义(P=0.948);结论1连续8周高脂饮食成功建立了大鼠脂肪肝胰岛素抵抗模型。该模型的病理特征为肝细胞呈大泡性脂肪变性,伴小叶内炎症细胞浸润、一定程度的肝纤维化和线粒体结构的异常;代谢特征为胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高脂血症、和血清转氨酶升高。该模型与人类肥胖所致NAFLD的病理和代谢改变极其相似,造模简单、模型成功率高,为研究NAFLD的发病机制,筛选有效的防治药物提供了良好的工具。2红曲能有效的拮抗大鼠NAFLD的进程,其作用机制为:①红曲能够改善NAFLD模型大鼠的一般情况:如改善大鼠模型的精神状况、耗食量、以及营养状况。②肝脏病理学观察表明红曲能改善肝脏脂肪变性,减少肝细胞坏死以及炎性细胞浸润。③红曲降低NAFLD模型大鼠血清ALT、AST含量,但无明显降低血甘油三脂的效应。提示红曲能有效减轻炎症反应,保护肝细胞,减轻脂肪性肝炎改变。④红曲降低NAFLD模型大鼠胰岛素抵抗及高胰岛素血症,增加胰岛素敏感性,从而阻断“初次打击”。⑤红曲降低NAFLD模型大鼠组织中TNF-α的表达,改善肠原性内毒素血症,从而抑制选择性胰岛素抵抗,阻断“二次打击”,抑制脂肪肝的发生。⑥红曲能升高NAFLD模型大鼠PPARα的mRNA及其蛋白质的表达,促进脂肪β氧化,减少脂肪肝毒性损害,发挥缓解脂肪肝的效应。综上所述,红曲可能通过改善胰岛素抵抗,抑制促炎因子TNF-α表达,发挥抗炎效应;诱导肝细胞PPARα的mRNA和蛋白水平增加,维持体内脂质代谢的动态平衡,发挥多环节、多靶点拮抗NAFLD的药理效应。