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蛋白质量控制系统是原核和真核细胞中广泛存在的一种蛋白降解机制,对于维持细胞内环境的稳定和调节细胞对于环境条件改变尤其是逆境胁迫适应发挥作用。蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)0-9是前期研究中从小麦根系分离得到的一株内生细菌,能产生芽孢和生物薄膜,具有较强的运动能力,能够在小麦内部稳定生存,对于包括小麦纹枯病和小麦根腐病等多种植物土传病害具有生防能力。生防细菌对于环境的高度适应是其发挥作用的前提。目前,有关B.cereus中是否存在蛋白质量控制系统尚未见报道。研究召.cereus的蛋白质量控制系统有助于揭示回答细菌的环境适应机制,对于开发植物病害生防制剂奠定基础。本研究利用基因序列分析软件分析B.cereus 0-9基因组序列,分析出与依赖Clpx/Hspl00蛋白家族相关功能性基因共11基因。通过进行引物设计,构建敲除载体,完成敲除载体的遗传转化,最终成功构建11个基因缺失菌株。分别是0-9(△clpB)、0-9(△clpC)、0-9(AclpPl)、0-9(△clpP2)、0-9(△ftsH)、0-9(△clpX)、0-9(△tepA)、0-9(△lonN)、0-9(△lonB)、0-9(△hsIV)和 0-9(△hsIU)。测定上述11个基因缺陷型菌株和0-9野生型菌株在群体生长,芽孢产生,运动性,生物薄膜形成,氧化胁迫耐受性等表型。结果显示,缺失ClpX和ftsH基因时,基因缺失突变体与0-9野生型菌株表型差异明显,均表现出运动能力变小,不能产生芽孢,在营养缺乏的合成培养基上生长较差,对氧化胁迫耐受能力降低等。同时发现,clpX和ftsH基因缺失突变体在细菌分裂和抗菌物质产生等方面存在不同。其它9个基因缺失突变体在蛋白酶产生、运动性等方面也存在一定的差异。上述结果表明蜡样芽孢中,蛋白质量控制系统组分影响细菌的多种生理功能。为了分析基因ftsH和clpX与表型变化的关系,分别从B.cereus0-9菌株的基因组中扩增出含有各自启动子的ftsH阅读框和ClpX阅读框,插入到穿梭质粒pAD123-1-pgal的多克隆位点构建基因互补载体,将ftsH和clpX的互补载体分别转入0-9(△ftsH)突变体和0-9(AclpX),构建ftsH基因互补菌株0-9(△ftsH::ftsH 和clpX基因互补菌株0-9(△clpX::clpX)。测定野生型、基因缺失菌株及其互补菌株的表型、发现基因互补后能够恢复突变表型,菌株恢复了产芽孢能力和运动能力,也恢复了在合成培养基上的生长能力,表明ftesH与clpX基因同时在菌株的芽孢形成、生物膜产生、运动性及群体生长中发挥作用。同时证明ftsH基因和clpX分别细菌分裂和抗菌物质产生中起作用。为了进一步分析ClpX在维持细菌蛋白稳定中发挥作用,利用荧光定量PCR测定了clpX基因在细菌不同胁迫条件下的表达,发现在酸胁迫和盐胁迫条件下,clpX的表达量增加。在此基础上,构建含有ssrA标签的GPF表达载体并转入0-9野生型和clpX缺失菌株,测定GFP-ssrA融合蛋白在不同菌株的表达,结果显示,GFP-ssrA融合蛋白在0-9野生型中能够被迅速降解,而在clpX突变菌株中高水平表达。上述结果表明,蜡样芽孢杆菌ClpX能够降解异常蛋白发挥保持细胞蛋白的稳定。