第一部分高糖高脂培养对巨噬细胞IL-18水平及内皮细胞功能的影响目的:糖尿病主要的长期慢性并发症是血管疾病,而血管疾病又是糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者发病率和死亡率增加的主要原因。糖尿病加速动脉粥样硬化的发病机制是多因素的,涉及载脂蛋白和脂蛋白颗粒异常之间的相互作用分布,高胰岛素血症,生长因子表达的改变和细胞因子的产生等。此外,大量证据表明,炎症过程在动脉粥样硬化病变,破坏和血栓形成过程中起着重要作用。最初被描述为IFN-y诱导因子的IL-18是IL-1细胞因子家族的成员,并且已知其有助于慢性免疫炎症过程的发病机制。IL-18在许多不同细胞中组成产生。类型包括巨噬细胞,血管平滑肌细胞和脂肪细胞。然而有关IL-18参与糖尿病血管病具体的发生发展的机制目前尚不明确。本部分的研究明确高糖高脂培养对巨噬细胞IL-18水平及内皮细胞中IL-18结合蛋白(IL-18BP)水平和粘附效应的影响。方法:用正常糖NG(5.6+19.4mmol/L甘露醇)或高糖HG(25mmol/L)联合300μmol/L水平棕榈酸处理的小鼠巨噬细胞系(RAW 267.4)24 h后通过定量PCR检测内皮白介素 18(Interleukin-18,IL-18)mRNA水平、Western-blotting检测IL-18蛋白水平及酶联免疫吸附法检测IL-18分泌,通过同样的条件处理内皮细胞后定量PCR及Western-blotting检测白介素18结合蛋白(Interleukin-18 binding protein,IL-18BP)基因和蛋白水平的变化。观察高糖联合游离脂肪酸处理对内皮细胞表面粘附分子血管细胞粘附分子(Vascular cell adhesion molecules,VC AM-1)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,IC AM-1)表达的影响及内皮细胞在THP-1细胞株上的粘附。同时通过IL-18中和抗体,观察IL-18中和对内皮细胞表面上述粘附分子的表达及内皮细胞在THP-1细胞株上的粘附的影响。所有统计学分析均采用SPSS13.0软件包处理,所有数据均以X±s表示,采用Studentt检验用于比较两均值间的差异,One-way ANOVA法(方差分析)用于比较多个参数间的差异。根据p值是否小于0.05判断有无统计学意义。结果:高糖或高糖联合棕榈酸处理后小鼠巨噬细胞中IL-18 mRNA(四组IL-18 mRNA 的相对水平分别为 1.0 ±0.1、2.1 ±0.28、0.94 ±0.23、1.8 ±0.2)和Western-blotting的结果显示IL-18的蛋白(四组IL-18蛋白的相对水平分别为1.0、1.52±0.08、0.79±0.22、1.59±0.15)的水平显著升高,同时增加巨噬细胞IL-18 分泌(四组 IL-18 蛋白的水平分别为 2.0±0.41、1.2±0.17、2.59±0.52、5.34±1.21)。(与NG组比较,P<0.05)。高糖联合棕榈酸处理后人脐静脉内皮细胞中IL-18BP的mRNA和蛋白水平显著下降(六组IL-18BPmRNA的相对水平分别为 1.0±0.09、1.0±0.04、1.06±0.13、0.56±0.06、1.00±0.05、0.49±0.05)。(与NG组相比P<0.05)高糖联合棕榈酸处理后人脐静脉内皮细胞表面粘附分子ICAM-1(四组ICAM-1蛋白的水平分别为1.0±0.05、4.1±0.83、3.56±0.36、4.78±1.00)及 VCAM-1(四组 VCAM-1 蛋白的水平分别为 1.0±0.05、10.56±2.66、18.22±1.94、11.85±1.65)显著升高。(与 NG 组相比 P<0.05)此外,IL-18能够显著增加THP-1的细胞粘附,这种增加细胞粘附的效应能够通过加入IL-18中和抗体进行中止(四组粘附细胞的数量分别为:58±11、100±10、139±12、78±6)。(与 NG 组相比 P<0.05)。结论:由IL-18/IL-18BP途径的失调是引起内皮细胞功能障碍的机制之一,高糖状态下内皮细胞VCAM-1高表达,单核细胞/巨噬细胞粘附增加可能与糖尿病动脉粥样硬化斑块形成加速有关。第二部分IL-18对平滑肌细胞功能的影响及可能的机制目的:动脉粥样硬化被认为是一种慢性炎症性疾病,其特征在于增强的促炎细胞因子,趋化因子和粘附分子的表达。细胞因子,趋化因子和浸润性免疫细胞之间的串扰放大了血管壁中的炎症级联反应,导致动脉粥样硬化形成。白细胞介素-18(IL-18)是一种促炎和致动脉粥样硬化的细胞因子,可诱导其他促炎细胞因子和粘附分子的表达。IL-18已定位于人类动脉粥样硬化病变,并且在急性冠状动脉综合征中增加的循环IL-18已被证明可预测未来的心血管事件。已经证实血清IL-18水平与颈动脉内膜中层厚度之间存在正相关。使用IL-18会加重小鼠的动脉粥样硬化。此外,IL-18缺陷的apoE敲除小鼠的动脉粥样硬化形成减少,表明IL-18在动脉粥样硬化的发展和进展中具有因果作用。最近,有研究证明了IL-18诱导人主动脉平滑肌细胞(smoothmusclecells,SMCs)增殖。然而,尚不清楚IL-18是否诱导SMC迁移。本部分研究的目的是明确IL-18对血管平滑肌迁移的作用效应并探讨相关的机制。方法:体外建立血管平滑肌Transwell迁移体系后,通过IL-18刺激后观察细胞的迁移情况。通过利用金属基质蛋白MMP3或MMP8抑制剂,MMP2、MMP9的siRNA和相关抑制剂,观察参与IL-18介导血管平滑肌迁移的效应分子。同时建立不同浓度和不同时间处理IL-18刺激血管平滑肌体外系统,通过定量PCR及Western-blotting检测MMP-9的基因和蛋白的水平。通过肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)联合IL-18处理血管平滑肌细胞后检测MAPK通路,PI3K通路及NF-κB通路的是否参与到细胞IL-18的作用效应中,同时利用MAPK通路,PI3K通路及NF-κB通路的抑制剂验证相关通路是否参与到IL-18介导血管平滑肌迁移作用效应中。结果:IL-18处理能够显著增加人主动脉血管平滑肌细胞迁移,这种效应通过IL-18抗体中和能够进行逆转(四组数值分别为:100±5、300± 15、290±15、150±8)。(与control组相比P<0.05)。IL-18刺激能够通过剂量和时间依赖的方式增加MMP-9基因水平的增加及活性MMP-9增加(5组数值分别为:1 ±0.05、2.5±0.15、5±0.25、10±0.5、12±0.6),而IL-18中和抗体的加入能够逆转由IL-18引起的活性MMP-9水平增加的情况(6组数值分别为:1、1±0.05、1.2±0.06、5±0.25、8±0.4、10±0.5),(与 control 组相比 P<0.05)。同时 MMP9抑制或沉默能够显著降低IL-18引起的人主动脉血管平滑肌细胞迁移增加。IL-18刺激能够增加人主动脉平滑肌细胞p-JNK、pERK、p-p38及p-AKT水平的增加,并且加入JNK、ERK、p38及AKT的抑制剂后,能够下调由IL-18引起的血管平滑肌细胞迁移的增加(7组数值分别为:100±5、300±25、285±20、200±10、190±10、195±10、180± 10)。(与 control 组相比 P<0.05)。NF-κB 通路的抑制能够下调由IL-18引起的人主动脉血管平滑肌细胞迁移的增加,NF-κB抑制剂Bayll-7082能够显著抑制由IL-18引起细胞迁移增加的情况(4组数值分别为:100±5、300±25、285±20、180±10)。(与 control 组相比 P<0.05)。结论:IL-18对于血管平滑肌迁移的促进作用可能是通过影响MMP9、MAPK、PI3K及NF-κB相关信号通路得以实现。第三部分IL-18相关circRNA-001175调控高糖引起内皮细胞功能失调的效应目的:环状RNA(circRNA)是一种新型的RNAs,研究发现,circRNA富含miRNA结合位点,可以发挥竞争性内源RNA作用,作为miRNA“海绵”来接触对其靶基因的抑制效应。近些年来,circRNA作为一种新型调控分子调控miRNA功能的发挥,可能调控细胞中的基因表达。它也参与各种生物过程。高血糖应激是心血管疾病的主要危险因素之一。它可以诱导血管内皮细胞凋亡。通过文献资料检索,circRNA-001175在糖尿病AS中具有差异性表达,然而,在高葡萄糖条件下,circRNA-001175的作用和生物学功能尚不清楚,并且对其机制的研究甚少。本研究的目的是研究circRNA-001175在高葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的作用及可能的作用机制,为糖尿病AS提供一定的靶向治疗依据。方法:通过纳入糖尿病患者并检测糖尿病患者循环中cirRNA-001175水平同时检测血清IL-18水平,通过Pearson检验进行相关性分析。通过体外建立人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC),分别通过高糖和正常糖处理后,观察circRNA-001175的表达模式。通过基因操作进行circRNA-001175模拟物的转染,通过MTS法和EdU法分析细胞增殖,Annexin V-PI染色检测细胞凋亡及成血管实验检测对内皮细胞成血管的影响。结果:采用Spearman相关法进行分析发现2型糖尿病患者血清IL-18的水平与circRNA-001175水平存在相关性,其中相关系数r=0.51,p=0.02。实时PCR结果显示葡萄糖处理以浓度依赖性方式逐渐降低circRNA-001175的表达,与对照组细胞相比p<0.05。CCK-8测定显示高葡萄糖处理显著降低细胞活力,而这种细胞活力的降低则能够通过上调circRNA-001175而逆转(与NC组相比,P<0.05)。此外,circRNA-001175转染对高葡萄糖处理诱导的增殖降低显示出保护作用。Hoechst染色和流式细胞术分析表明,circRNA-001175的上调能够抑制高葡萄糖处理诱导的HUVECs凋亡(与NC对照组相比P<0.05)。而且,体外成血管实验的结果观察到circRNA-001175的上调增加了 HUVEC在高葡萄糖下的成血管能力。结论:CircRNA-001175在高糖条件下对HUVECs具有保护作用,并且这种作用是通过影响IL-18的分泌得以发挥的效应的。CircRNA-001175很有可能成为诊断或预测高血糖疾病的生物标志物,并为疾病的治疗提供新的见解。