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先天性全身脂肪营养不良 Ⅱ 型(congenital generalized lipodystrophy type 2,CGL2)是以脂肪萎缩伴有糖脂代谢紊乱为主要临床特征的常染色体隐性遗传病。CGL2患者还会发生认知功能和运动功能障碍,但是有关其发病机制迄今仍然不清楚。seipin基因的无义突变(seipin缺失)被认为是CGL2的主要基因型改变。seipin蛋白是两次跨膜的内质网固有蛋白,在中枢神经系统特异性高表达。有文献报道,帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者黑质区的seipin表达水平低于正常人群。黑质多巴胺神经元通过黑质-纹状体通路,参与基底节的运动调节。PD的主要病理特征是黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺神经元的路易小体形成,导致多巴胺神经元丢失。路易小体形成的主要病理机制是α-突触核蛋白(α-synuclein,αSyn)聚集和纤维化。我们的预实验结果发现黑质的多巴胺神经元表达seipin蛋白。我们的前期研究已证明,seipin缺失能抑制神经细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARy)的表达和活性。PPARγ水平降低可以提高糖原合成酶激酶 3β(glycogen syntheses kinase 3 beta,GSK3β)的活性。GSK3β 过活性又可以促进αSyn的磷酸化和神经炎性的增加。因此,本课题提出“seipin缺失有可能通过降低PPARy的水平改变αSyn的聚集和纤维化,从而导致多巴胺神经元丢失和运动协调功能障碍”的科研设想。研究目标:明确seipin缺失对多巴胺神经元的影响及其分子机制。实验方法:1.动物模型的制备和鉴定:seipin基因全身敲除(seipin-sKO)小鼠、seipin基因神经系统敲除(seipin-nKO)小鼠和seipin基因脂肪细胞敲除(seipin-aKO)小鼠模型由北京大学医学院刘国庆教授提供。提取尾部DNA,用PCR方法鉴定基因型。本研究使用3月龄、8月龄和12月龄的雄性seipin-nKO小鼠和同窝野生型(nWT)小鼠,8月龄雄性seipin-sKO小鼠和同窝野生型(sWT)小鼠和seipin-aKO小鼠和同窝野生型(aWT)小鼠。2.通过平衡木实验和转棒实验检测小鼠的运动协调和平衡功能。3.用seipin和TH免疫双染,TH免疫组织染色,SNpc的TH阳性(TH+)细胞计数。4.用蛋白免疫印记法(Western-Blot)检测黑质区seipin、αSyn、磷酸化αSyn、PPARγ、GRP78、CHOP、GSK3β、caspase-3。5.用酶联免疫分析法(ELISA)检测黑质IL-6、TNF-α水平。6.用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测黑质区PPARy的mRNA水平。实验结果:1.与同龄nWT小鼠相比,8月龄和12月龄seipin-nKO小鼠穿越平衡木时间延长,转棒实验的落杆潜伏期明显缩短,而3月龄seipin-nKO小鼠没有显著差异。与同龄sWT小鼠相比,8月龄seipin-sKO小鼠平衡木时间延长,落杆潜伏期减少,而8月龄seipin-aKO小鼠的平衡木时间和落杆潜伏期与同龄aWT小鼠相比没有明显差异。这些结果显示神经系统seipin缺失引起年龄相关的运动协调减退。2.在nWT小鼠,SNpc多巴胺神经元表达seipin。与同龄nWT小鼠相比,8月龄和12月龄seipin-nKO小鼠SNpc的TH+细胞数目减少,而3月龄seipin-nKO小鼠没有明显改变。这些结果显示神经系统seipin缺失可以引起与年龄相关的多巴胺神经元丢失。3.与同龄nWT小鼠相比,8月龄seipin-nKO小鼠黑质αSyn聚集体(70-100 kD)水平和αSyn聚集体磷酸化水平明显增高,但是αSyn单体(19 kD)和单体磷酸化水平没有明显变化;SNpc多巴胺神经元中αSyn纤维化水平增加。但是3月龄seipin-nKO小鼠与nWT小鼠相比没有明显改变。这些结果提示神经系统seipin缺失引起年龄相关的αSyn聚集、磷酸化以及纤维化。4.与同龄nWT小鼠相比,3月龄和8月龄seipin-nKO小鼠黑质PPARγ水平明显降低。3月龄和8月龄seipin-nKO小鼠黑质GSK3β的Tyr216位点磷酸化水平增加和Ser9位点磷酸化水平降低,提示GSK3β活性增高。8月龄seipin-nKO小鼠IL-6水平明显高于nWT小鼠,而3月龄seipin-nKO小鼠没有明显改变。5.PPARγ激动剂罗格列酮(Rosi)连续7天处理能降低seipin-nKO小鼠的GSK3β活性。Rosi或GSK3β抑制剂AR-A014418连续7天处理能降低seipin-nKO小鼠IL-6水平增高。这些结果提示,seipin缺失通过降低PPARy水平,引起GSK3β活性增加,导致年龄相关的神经炎性因子水平增加。6.Rosi连续28天处理能明显阻止seipin-nKO小鼠αSyn聚集和磷酸化水平增加。而AR-A014418处理能明显减少αSyn磷酸化,但不影响αSyn聚集的增加。7.8月龄seipin-nKO小鼠黑质活化caspase-3水平明显增加,而3月龄seipin-nKO小鼠没有改变。Rosi或AR-A014418连续28天处理能降低caspase-3活化,减少多巴胺神经元丢失,并缓解运动协调功能障碍。结论:seipin缺失通过降低PPARy的水平,增强GSK3β的活性,促进αSyn的聚集和磷酸化和神经炎性,引起多巴胺神经元丢失,造成运动协调功能障碍。