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目的:利用低浓度黄曲霉毒素B1（AFB1）长期连续处理人正常食管上皮细胞（HEEC）至30代,采用p38 MAPK蛋白特异性抑制剂（SB203580）抑制染毒30代细胞的p38 MAPK信号通路,观察HEEC的生长活力、周期、凋亡等生物学功能的改变,并检测上皮-间充质转变（EMT）相关蛋白、周期相关蛋白及p38 MAPK信号通路相关蛋白表达的表达。从而探讨AFB1在HEEC恶性转化过程中,发挥的致癌作用及其与p38 MAPK信号通路的关系,进一步探索AFB1在食管癌发生过程的相关分子机制,为食管癌的病因学研究奠定基础,为防止食品中AFB1对食管的毒性提供一定的理论依据。方法:（1）低浓度AFB1长期染毒HEEC致恶性转化作用研究:HEEC暴露于含0、0.01、0.1、1、10、100、1000μmol/L的AFB1培养液24 h后,检测其对HEEC活性的影响。随后选择1μmol/L AFB1长期连续处理HEEC 30代,以未染毒的HEEC为对照组,每间隔5代,观察细胞的生长形态,采用CCK8法来检测AFB1染毒不同代数的HEEC活力的影响,采用流式细胞仪检测不同代数细胞的细胞凋亡、细胞周期,采用Transwell法检测染毒30代细胞的侵袭、迁移个数的变化。（2）p38 MAPK信号通路在HEEC恶性转化细胞株的作用研究:AFB1染毒30代的细胞暴露于0、1、10、100、1000μmol/L的SB203580 24 h,检测SB203580对细胞活性的影响。随后选择0、25μmol/L的SB203580干预AFB1染毒30代的细胞24 h后,采用CCK8法检测SB203580对细胞活力的影响,采用流式细胞仪检测SB203580对细胞凋亡、细胞周期的变化。（3）HEEC恶性转化细胞株的功能相关蛋白表达:将正常食管上皮细胞、1μmol/L AFB1染毒30代的细胞株、1μmol/L AFB1+25μmol/L SB203580的染毒30代细胞株培养24 h后,采用Western blot法检测EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin）、细胞周期相关蛋白（cyclin A2、cyclin D1及CDK2）、p38 MAPK信号通路相关蛋白（p38、p-p38）的表达。结果:1.低浓度AFB1长期染毒HEEC致恶性转化作用研究:（1）当HEEC暴露于不同浓度AFB124 h后,随着AFB1浓度不断增加,细胞活力逐渐下降,呈剂量依赖性。半数抑制浓度（IC50）为169.3μmol/L。选择对细胞损伤较小的AFB1浓度:1μmol/L,长期处理HEEC。（2）细胞形态学观察发现,随着AFB1染毒代数的增加,细胞体积变大,形态松散、细长,伴有伪足形成,出现了类似EMT改变,与对照组有明显差异。（3）CCK8检测结果显示,与对照组相比,染毒初期（第5代、第10代）细胞增殖率升高（P<0.01）,染毒中期第15代细胞差异无统计学意义（P>0.05）,染毒中期第20代、染毒后期（第25代、第30代）细胞增殖率明显升高（P<0.01）。在长期低浓度AFB1作用下,细胞的增殖能力先升高,随后降低,然后再升高,在第30代增殖能力最强。（4）细胞周期检测结果显示,与对照组相比,染毒初期（第5代、第10代）细胞G0/G1期比例增加,S期比例降低,增殖指数PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）降低（P<0.05）,染毒中期（第15代、第20代）细胞G0/G1期比例、增殖指数PI差异无统计学意义（P>0.05）。染毒后期（第25代、第30代）细胞G0/G1期比例降低,S期比例增加,增殖指数PI增加（P<0.05）,在长期低浓度AFB1作用下,细胞周期经历了G0/G1期阻滞,随着AFB1染毒代数的增加,细胞周期从G0/G1期向S期转化。（5）细胞凋亡检测结果显示,随着AFB1染毒代数的增加,细胞的总凋亡率变化趋势呈阶段性。与对照组相比,染毒初期（第5代、第10代）细胞总凋亡率逐渐增加,第15代细胞总凋亡率最高,随后,细胞凋亡率呈下降趋势（P<0.05）。与对照组相比,第30代细胞总凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。（6）细胞迁移、侵袭实验结果显示,与对照组相比,染毒第30代细胞迁移、侵袭数量均增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2.p38 MAPK信号通路在HEEC恶性转化细胞株的作用研究:（1）当AFB1染毒的30代细胞暴露于不同浓度的SB203580 24 h后,随着AFB1浓度升高,细胞活力呈先降低再升高再降低的趋势（P<0.01）,IC 50值为85.36μmol/L。选择IC 50值的1/3浓度:25μmol/L对AFB1染毒30代细胞进行干预。（2）CCK8检测结果显示,与染毒30代细胞组相比,SB203580组细胞活力降低,差异有统计学意义（P<0.01）。（3）细胞周期检测结果显示,与染毒30代细胞组相比,SB203580组细胞G0/G1期比例增加,S期比例降低,G2/M期比例降低,增殖指数PI降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）细胞凋亡检测结果显示,与染毒30代细胞组相比,SB203580组细胞总凋亡率增加（P<0.05）。3.HEEC恶性转化细胞株的功能相关蛋白表达:（1）检测EMT相关蛋白结果显示,对照组、染毒30代细胞组、SB203580组细胞E-cadherin蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05）,N-cadherin蛋白差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组相比,染毒30代细胞组E-cadherin蛋白表达降低（P<0.05）。与染毒30代细胞组相比,SB203580组E-cadherin、N-cadherin蛋白表达增加（P<0.05）。（2）检测细胞周期相关蛋白结果显示,对照组、染毒30代细胞组、SB203580组细胞cyclin A2、cyclin D1蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05）,CDK2蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组相比,染毒30代细胞组cyclin A2蛋白表达升高（P<0.05）。与染毒30代细胞组相比,SB203580组cyclin A2蛋白表达降低（P<0.05）,cyclin D1蛋白表达增加（P<0.05）。（3）对照组、染毒30代细胞组、SB203580组细胞p38、p-p38蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,染毒30代细胞组p-p38蛋白表达增加（P<0.05）。与染毒30代细胞组相比,SB203580组p38、p-p38蛋白表达显著降低（P<0.05）。结论:（1）AFB1可呈剂量依赖性的抑制HEEC活力,经1μmol/L AFB1染毒30代细胞后,细胞形态出现类似EMT样的改变;细胞增殖率升高;细胞周期从G0/G1期向S期转化;细胞总凋亡率无明显变化;细胞迁移、侵袭能力增加,出现恶性转化的趋势。（2）低剂量SB203580干预下,细胞存活率短暂升高,随着浓度逐渐增加,细胞存活率降低,抑制作用增加。采用25μmol/L SB203580处理1μmol/L AFB1染毒30代细胞,细胞活力降低,G0/G1期阻滞,总凋亡率增加,SB203580可以抑制AFB1染毒30代细胞的增殖。因此,AFB1可通过p38 MAPK信号通路,导致HEEC增殖能力增加,出现恶性转化的趋势。（3）1μmol/L AFB1在染毒HEEC 30代的过程中,可下调E-cadherin蛋白表达、上调cyclin A2蛋白表达引起周期等指标的变化,从而促进细胞增殖。同时,通过上调p-p38蛋白表达,表明AFB1可作用于p38 MAPK信号通路发挥其作用。25μmol/L SB203580可通过下调p38蛋白、p-p38蛋白表达,抑制p38 MAPK信号通路。并上调E-cadherin蛋白表达,下调cyclin A2蛋白表达,进而抑制细胞增殖。因此,AFB1可通过作用于p38 MAPK信号通路,下调E-cadherin蛋白表达、上调cyclin A2蛋白表达,导致细胞形态出现类似EMT样改变,细胞周期从G0/G1期向S期转化,侵袭与迁移能力增加,细胞增殖能力增加,出现恶性转化的趋势。