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胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一,近年来其发病率呈上升趋势,然而其发病机制仍未确切阐明。非编码RNA（non coding RNA,ncRNA）是一类不编码蛋白质的RNA分子,研究发现其对肿瘤的生物学行为具有重要的调控作用。根据非编码RNA的长度,可以将其分为微小非编码RNA（microRNA,miRNA）和长链非编码RNA（long nocoding RNA,lncRNA）。本研究中我们以miR 212和H19为切入点,分别探讨miRNA和lncRNA在胰腺癌发生、发展中的作用及机制。通过qRT PCR、Western Blot、双荧光素酶报告基因实验、CCK 8实验、平板克隆实验、细胞划痕和Transwell侵袭实验发现miR 212和H19在胰腺癌中都发挥促癌基因作用。miR 212与胰腺癌的TNM分期密切相关,并且miR 212能够通过对其靶基因Patched 1（PTCH1）调控发挥其促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用;H19与胰腺癌的转移密切相关,并且H19能够通过拮抗let 7对其靶基因高迁移率家族蛋白2（High Mobility Group AT hook2,HMGA2）的调控并介导上皮间质转化（Epithelial Mesenchymal transition,EMT）促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。通过上述研究阐明了miR 212和H19在胰腺癌中发挥的重要作用及具体机制,为非编码RNA在胰腺癌中发挥的重要作用增添了新的依据,并为胰腺癌的治疗提供了新的潜在靶点。第一部分miR 212通过调控Hedgehog信号通路中的patched 1促进胰腺癌的增殖和侵袭【目的】探讨miR 212在胰腺癌中的表达情况,miR 212对胰腺癌细胞的生物学功能的影响及其作用机制【方法】使用qRT PCR检测miR 212在胰腺癌组织、配对的癌旁组织以及胰腺癌细胞系中的表达情况;将胰腺癌细胞分组三组,分别转染miR 212 mimic、miR 212inhibitor和negative control,CCK 8实验检测miR 212对胰腺癌细胞增殖活性的影响,平板克隆实验检测miR 212对胰腺癌细胞克隆形成能力的影响,细胞划痕实验检测miR 212对胰腺癌细胞迁移能力的影响,Transwell实验检测miR 212对胰腺癌细胞侵袭能力的影响。采用生物信息学方法预测miR 212的靶基因,并使用双荧光素酶报告基因实验、qRT PCR和Western Blot实验验证预测的miR 212靶基因。使用qRT PCR和免疫组织化学方法检测验证出的miR 212靶基因在胰腺癌组织中的表达情况,TCGA数据挖掘miR 212靶基因和胰腺癌患者预后的关系,spearman相关性分析查看miR 212的表达量和其靶基因的表达量在胰腺癌中的相关性。最后,共转染miR 212和靶基因,并通过CCK 8实验、细胞划痕实验、Transwell实验验证miR 212是否通过调控靶基因对胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭产生影响。【结果】qRT PCR结果显示相对于癌旁组织,miR 212在胰腺癌组织中呈高表达,并且相对正常胰腺导管上皮细胞,miR 212在胰腺癌细胞系PANC 1、SW1990和Bx PC 3中均高表达。转染miR 212 mimic、miR 212 inhibitor和negative control后,CCK 8结果显示miR 212能够增强胰腺癌细胞的增殖能力,平板克隆形成实验结果显示miR 212能够增强胰腺癌细胞克隆形成能力,细胞划痕实验结果表明miR 212能够促进胰腺癌细胞发生迁移,Transwell实验结果显示miR 212能够增强胰腺癌细胞的侵袭能力。生物信息学软件预测发现Hedgehog信号中的膜蛋白PTCH1是miR 212的潜在靶基因。通过双荧光素酶报告基因、qRT PCR和Western Blot实验验证了在胰腺癌细胞在中,PTCH1是miR 212的靶基因。qRT PCR和免疫组织化学结果也显示PTCH1在胰腺癌中呈低表达,并且PTCH1的表达量和miR 212的表达量呈负相关,TCGA数据也显示PTCH1与胰腺癌患者预后相关。这些结果提示miR 212的靶基因PTCH1在胰腺癌中发挥着抑癌基因的作用。为了探讨miR 212是否通过对PTCH1的调控发挥其对胰腺癌细胞生物学功能的影响,我们将PTCH1和miR 212mimic共转染胰腺癌细胞,结果发现PTCH1能够部分逆转由miR 212介导的胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化,说明miR 212能够通过调控PTCH1的表达行驶其促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。【结论】miR 212在胰腺癌组织中高表达,miR 212能够通过靶向调控PTCH1促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第二部分长链非编码RNA H19通过拮抗let 7对其靶基因HMGA2的抑制并介导EMT促进胰腺癌的转移【目的】探讨H19在胰腺癌中的表达情况,H19对胰腺癌侵袭、转移的影响以及作用机制【方法】使用qRT PCR方法检测H19在胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中的表达情况,根据胰腺癌是否发生转移将胰腺癌组织标本分为发生转移组和未发生转移组,比较两组中H19的表达情况。使用实时细胞分析系统比较三株胰腺癌细胞PANC 1、SW1990和Bx PC 3的迁移和侵袭能力,并分析H19在这三株胰腺癌细胞中的表达量与其迁移、侵袭能力的相关性。通过细胞转染将H19 siRNA转染进胰腺癌细胞以得到H19低表达的胰腺癌细胞,利用细胞划痕实验和Transwell实验比较H19 siRNA转染组和negative control转染组胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。qRT PCR、Western Blot检测H19抑制表达后对let 7及其靶基因HMGA2以及EMT标志蛋白E cadherin、N cadherin、Vimenin的影响。最后通过共转染H19 siRNA和let 7 inhibitor并通过细胞划痕和Transwell实验验证H19是否通过let 7发挥其对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响。【结果】qRT PCR结果显示不仅相比较癌旁组织,H19在胰腺癌中高表达,而且H19在发生转移的胰腺癌组织中的表达显著高于未发生转移的胰腺癌组织。同时,H19在胰腺癌细胞系PANC 1、SW1990、CFPAC 1、As PC 1和Bx PC 3中均高表达,实时细胞分析系统显示在PANC 1、SW1990和Bx PC 3三株胰腺癌细胞中,迁移、侵袭能力依次递减,而这三株胰腺癌细胞系中H19的相对表达量也顺次递减,组织和细胞实验都提示H19与胰腺癌的侵袭和转移相关。通过细胞转染将胰腺癌细胞PANC 1分为H19 siRNA组和siRNA control组,24小时后细胞划痕和Transwell侵袭实验表明H19抑制表达组细胞迁移、侵袭能力均明显降低。Western Blot实验结果表明H19 siRNA能够显著抑制let 7靶基因HMGA2的蛋白水平,同时导致EMT标志蛋白E cadherin升高和N cadherin、Vimentin蛋白下调。最后共转染H19 siRNA和let 7 inhibitor后,细胞划痕和Transwell实验表明let 7能够部分逆转由H19介导的胰腺癌细胞迁移、侵袭能力的改变,说明H19能够通过拮抗let 7发挥其对胰腺癌侵袭和转移的影响。【结论】H19在胰腺癌中高表达;H19与胰腺癌的转移密切相关;H19能够通过拮抗miRNA let 7对其靶蛋白HMGA2的调控并促进EMT发挥其促进胰腺癌侵袭和转移的作用。