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低聚半乳糖(Galactooligosaccharide)是一类功能性低聚糖,具有多种生理功能;烷基糖苷(Alkyl Polyglycoside)是新一代环保型绿色表面活性剂,广泛应用在食品和洗涤剂等领域。这两类糖苷化合物传统的合成方法是化学法,但因其繁琐的前处理而大大限制了工业生产,因此高效、安全、条件温和的酶法成为首要选择。糖基转移酶和糖苷酶是两种主要类型,其中糖基转移酶由于种类稀少且价格昂贵等限制条件而不适合大规模生产,因此来源广泛并且具有转糖苷活性的糖苷酶成为工业生产糖苷化合物的新选择。由于高温利于提高底物溶解性,降低粘度,减少工业成本和预防微生物污染等特点,因此,本论文以嗜热厌氧乙醇杆菌Thermoanaerobacter ethanolicus JW200和海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8所产的β-葡萄糖苷酶(Te-BglA和Tm-BglA)为研究对象,通过定点突变替换结合位点的关键氨基酸,利用不同的底物探究修饰后β-葡萄糖苷酶的转糖苷活性。1、重组Te-BglA和Tm-BglA转糖苷活性的研究。通过在大肠杆菌中重组表达,再利用镍离子亲和柱纯化得到重组酶Te-BglA和Tm-BglA。分析单糖对酶活力的影响,发现与Te-BglA相比,L-葡萄糖对于Tm-BglA的激活作用更明显。探究重组酶的底物特异性时,发现Te-BglA和Tm-BglA对于底物pNPGlc和纤维二糖的特异性更强。通过薄层色谱法与高效液相色谱法结合,分析重组酶Te-BglA和Tm-BglA分别以乳糖、pNPG、葡萄糖和纤维二糖为底物的转糖苷活性,发现Te-BglA的转糖苷活性优于Tm-BglA,尤其在纤维二糖为34 mM,加酶量为10 μg/ml,缓冲液pH为6.2,反应温度为60℃,反应时间延长到8 h时产物己基糖苷HG浓度达到18.2 mM。2、Tm-BglA的定点突变及其突变体酶学性质的研究。以耐热性更强的Tm-BglA作为模板,通过同源比对确定Tm-BglA的突变位点Glu166、Asn222、Tyr295、Glu351、Phe414,通过反向 PCR 技术得到 9 个突变体(E166A、N222F、N223C、N223Q、G224A、Y295F、E351A、F414S、W168S-N246S),并对各突变体进行酶学表征,发现N223Q的最适pH增加到6.6,而其余突变体无明显变化,与Tm-BglA的最适pH 6.2保持一致;Y295F的pH稳定性较好,在pH4.2-8.2范围内能保持60%以上的残留活性,而其余突变体与Tm-BglA无明显变化;G224A和Y295F的最适温度为95℃,而其余突变体与Tm-BglA的最适温度90℃保持一致;Y295F的耐热性较好,在95℃保持lh有50%的残留活性,而其余突变体均降到40%以下;Y295F的乙醇耐受性比其余突变体明显增强;分析多种单糖对突变体酶活力影响,其中L-葡萄糖对各突变体的激活作用均较为显著;探究突变体的底物特异性,其中N222F、N223C、N223Q、G224A、W168Y-N246S对于人工底物pNPG的特异性均高于Tm-BglA;作用于pNPG时,N222F、N223C、N223Q、G224A、W168Y-N246S 的Km 值均低于 Tm-BglA,而 kcat/Km值高于Tm-BglA。3、Tm-BglA及其突变体转糖苷活性的研究。通过薄层色谱法初步定性筛选,又进一步通过高效液相色谱法定量分析三种底物(pNPG、葡萄糖和纤维二糖)的转糖苷反应历程,发现pNPG为34 mM,N222F加酶量为l0 μg/ml,缓冲液pH为6.2,反应温度为60℃,反应时间延长到8 h时转糖苷活性最强,产物HG浓度达到28.0 mM,相当于Tm-BglA的两倍。又研究转糖苷反应体系的影响因素,发现最适pH为6.2,最适水分含量为20%,最适反应温度为80℃,最适底物pNPG浓度为45 mM,最适纯酶N222F量为15 μg/mL,这为工业生产提供一定的理论基础。4、β-葡萄糖苷酶与底物的分子对接。运用Autodock软件模拟酶与底物结合的状态,研究突变前后酶与底物的结合情况。发现与Tm-BglA相比,N222F与底物pNPG的结合自由能明显降低,与pNPG糖苷键的空间距离显著缩短,说明疏水性较强的苯环基团更有利于底物pNPG糖苷键的断裂,进而与己醇结合,促进转糖苷反应的进行,对进一步提高表面活性剂——己基糖苷的生物转化率也具有重要的应用价值。