慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种严重危害人类健康的常见疾病。也一直是对人类健康与生命危害日趋加重的全球公共卫生问题。据估计,全世界大约有7000万名COPD患者。王辰等对中国2012至2015年我国慢性阻塞性肺疾病流行病学调查结果显示:我国慢阻肺患者人数约1亿,20岁以上成人的患病率为8.6%,40岁以上则达到13.7%,已成为与高血压糖尿病等量齐观的慢性疾病,构成重大疾病负担。很大比例的慢性阻塞性肺疾病的死亡是发生在急性加重期和随后几周,尤其是在严重急性加重住院的患者中。此外,COPD的急性加重是住院的主要经济负担,也是其医疗费用的主要支出部分,2020年将成为世界疾病负担的第三位。细菌和病毒感染,烟草暴露,以及一些工作场所的灰尘和烟雾、天气和空气质量可能是导致慢性阻塞性肺病症状恶化的关键因素。最近的流行病学调查显示:PM2.5和PM10是导致COPD的发病和死亡的危险因素。PM2.5、PM10、NO2、SO2和O3与慢性阻塞性肺病急性发作的发生发展密切相关。但是具体的机制仍不清楚。这些物质反复或持续暴露气道上皮引起上皮损伤,激活各种信号通路进行损伤的修复以保持其完整性。WNT(Wingless/Int)信号激活可能导致上皮细胞异常产生转化生长因子β(TGF-β)和诱导上皮间充质转换,调节组织修复和细胞外基质沉积,如纤维连接蛋白、基质金属蛋白酶等。目前在临床方面进行的空气污染物对慢性阻塞性肺疾病急性加重住院的影响,主要集中在流行病学调查,而且大多数的研究通常采用移动平均法,考虑污染物对AECOPD相关住院的滞后效应;然而,这种方法低估了累积效应。因此,我们采用了一种先进的方法,即泊松广义线性回归模型与分布滞后非线性模型(distributed lag nonlinear model,DLNM)相结合,估算了相对累积风险,并计算了空气污染物导致慢性阻塞性肺疾病急性加重住院的归因负担。为了进一步分析在冬春燃煤季空气污染物对AECOPD的影响,我们把整个时间序列分成供暖季和非供暖季,分析不同季节空气污染物的差别,不同季节空气污染物对AECOPD住院的累积相对风险和住院负担的差异。在基础研究方面我们研究PM2.5是否可以引起支气管上皮细胞外基质沉积、其致病机理如何均有待进一步研究。WNT-5A是广泛研究的非经典的WNT信号配体。除了促进炎症反应外,WNT-5A也参与细胞外基质沉积、气道重塑。WNT-5A可以诱导细胞外基质沉积在哮喘、肺间质纤维化中均有报道,在COPD中的发病机制仍不清楚,并且目前关于WNT-5A与PM2.5诱导的细胞外基质沉积方面的文献报道较少,而且,WNT-5A通过什么通路调节PM2.5诱导的细胞外基质沉积仍不清楚,还需进一步研究明确。我们的研究分为三部分:第一部分我们使用泊松广义相加回归模型与分布滞后非线性模型相结合,分析在石家庄市高空气污染水平下空气污染物对慢性阻塞性肺疾病急性加重住院的相对累积风险因素,并计算其引起住院的归因负担,按照年龄、性别进行分层分析,寻找易感人群。通过控制污染物水平,降低慢性阻塞性肺疾病急性加重住院风险,减轻经济负担。第二部分主要研究供暖季空气污染物与非供暖季空气污染物的差异,并分析不同季节空气污染物对慢性阻塞性肺疾病急性加重住院相对累积风险和归因负担的不同。第三部分为基础研究部分。拟以空气动力学直径<2.5μm的悬浮颗粒物PM2.5作为研究对象,在细胞模型中观察PM2.5对人支气管上皮细胞细胞外基质沉积的影响,进一步分析在细胞外基质沉积中WNT-5A表达水平的改变。WNT-5A的功能被阻断对PM2.5诱导支气管上皮细胞细胞外沉积的影响,并探讨WNT-5A与氧化应激、炎症反应通路的关系。第一部分 在石家庄地区空气污染物对慢性阻塞性肺疾病住院相关性、住院归因负担的影响目的:分析在石家庄市高污染水平下慢性阻塞性肺疾病住院的相对累积风险,并计算空气污染物引起其急性加重住院的归因负担。按照年龄、性别进行分层分析,寻找易感人群。通过控制污染物水平,降低慢性阻塞性肺疾病急性加重住院风险,减轻经济负担。方法:我们收集了 2013年1月1日至2016年12月31日期间石家庄市慢性阻塞性肺疾病急性加重住院数据、石家庄地区空气污染和气象数据。采用泊松广义线性回归模型与分布滞后非线性模型相结合的方法,通过控制长期趋势、季节模式、气象因素和其他可能的混杂因素,按照年龄、性别分层分析来评估滞后0-7天的相对累积风险和研究潜在的影响。然后,计算空气污染物引起住院的归因负担。结果:1.在本研究中共有9358例慢性阻塞性肺疾病急性加重期(男:女,2.61:1)患者,每天约有6例COPD急性加重住院。2.PM2.5、PM10、NO2、SO2和CO相对累积风险与慢性阻塞性肺疾病急性加重住院呈显著正相关;O3呈线性负相关。3.退休人群中PM2.5、PM10、SO2、NO2和CO引起 AECOPD 住院增加 2.4%(95%CI(1.015-1.032))、1.4%(95%CI(1.008-1.02))、3.4%(95%CI(1.013-1.055))、6.7%(95%CI(1.04-1.096))、1.8%(95%CI(1.011-1.024))高于非退休人群组。NO2引起的住院率最高为 6.7%。4.在女性人群中 PM2.5、PM10、SO2、NO2、CO 和 O3 引起 AECOPD住院增加 2.1%(95%CI(1.006-1.035))、1.3%(95%CI(1.003-1.023))、2.6%(95%CI(0.993-1.06))、5.7%(95%CI(1.013-1.103))、1.6%(95%CI(1.005-1.028))、1.6%(95%CI(0.987,1.046)高于男性,NO2 引起的住院率最高为5.7%。5.NO2的累积相对风险最大。每日NO2浓度每增加10μg/m3,在退休组和女性组因NO2导致AECOPD住院率分别增加6.7%和5.7%。6.13%(95%CI(5.5-20.4%或 1220 例入院)、9.4%(95%CI(-1.3-18.4%或879 例入院)、1.7%(95%CI(-10.9-12.6%或 156 例入院))、9.7%(95%CI(-3.4-21.2%或 905 例入院)和 8.8%(95%CI(-0.6%-17.3%或 828 例入院))的慢性阻塞性肺病住院可分别归因于PM2.5、PM10、SO2、NO2和CO。7.如果空气污染物24小时平均浓度下降至中国空气质量Ⅱ级标准,PM2.5,PM10,SO2,NO2和CO引起的AECOPD住院相关的归因百分比将分别减少 11.2%(95%CI(0.047,0.202),7.5%(95%CI(-0.010,0.182),0.5%(95%CI(-0.131,0.126),3.9%(95%CI(-0.035,0.222)和 3.2%(95%CI(0.000,0.177)。小结:1.空气污染物PM2.5、PM10、SO2、NO2和CO与AECOPD住院呈显著的正相关。2.这些关联具有个体差异。在女性人群中空气污染物与慢性阻塞性肺疾病急性加重住院的相关性大于男性、在退休人群中相关性大于非退休,退休人员和女性是易感人群。3.13%、9.4%、1.7%、9.7%和8.8%的AECOPD住院分别归因于PM2.5、PM10、SO2、NO2和 CO。4.如果24小时平均空气污染物浓度降至中国国家空气质量监测标准Ⅱ级水平,PM2.5和PM10的AECOPD归因于百分比将下降80%。第二部分 比较供暖季、非供暖季空气污染物对慢性阻塞性肺疾病住院相关性、住院归因负担的影响目的:主要研究供暖季空气污染物与非供暖季空气污染物的差异,并分析不同季节空气污染物对慢性阻塞性肺疾病住院相对累积风险因素和归因负担的不同。方法:把时间序列分成供暖季和非供暖季,采用泊松广义线性回归模型与分布滞后非线性模型相结合的方法,通过控制长期趋势、季节模式、气象因素和其他可能的混杂因素,来评估供暖季、非供暖季累积滞后7天的相对累积风险,然后计算空气污染物引起住院的归因负担。结果:1.在供暖季PM2.5、PM10、NO2、SO2、CO浓度(平均日均浓度 162.22±120.63μg/m3、263.16±164.32μg/m3、73.29±31.5μg/m3、106.49±74.65μg/m3、2.49±1.75mg/m3)高于非供暖季(84.13±60μg/m3、164.54±74.65μg/m3、46±20.6μg/m3、34.19±25.97μg/m3、1.0±0.5mg/m3);非供暖季O3(平均最大8h移动平均浓度109.54±50.2μg/m3)高于供暖季(39.79±27.83μg/m3)。2.在供暖季和非供暖季由 PM2.5、PM10、NO2和 SO2引起的累积7天相对风险与AECOPD住院显著正相关。然而,对于O3,在供暖季节表现出负相关,在非供暖季节表现出正相关。CO在供暖季表现正相关,在非供暖季表现出负相关。3.在供暖季PM2.5、PM10、SO2和NO2水平每增加10μg/m3,可以导致COPD累积7天的住院增加1.0%(95%CI(0.997、1.022)、0.5%(95%CI(0.995、1.014)、0.2%(95%CI(0.973、1.031)和 2.2%(95%CI(0.982、1.064)。但O3降低了 1.3%(95%CI(0.916,1.062)的COPD住院率。CO水平每增加0.1mg/m3与0.3%(95%CI(0.994,1.012)增加COPD住院有关。然而,非供暖季节我们发现PM2.5、PM10、SO2、NO2和O3的水平每增加10μg/m3,可以导致COPD累积7天的住院增加 2.6%(95%CI(1.008、1.045)、1.6%(95%CI(1.004、1.028)、5.3%(95%CI(0.991、1.118)、1.9%(95%CI(0.963、1.079)和 1.0%(95%CI(0.989、1.032)。CO 的水平每增加 0.lmg/m3 与 0.3%(95%CI(0.974,1.022)减少COPD住院有关。4.在供暖季分别有17.8%(95%CI(-0.34-34%或743 例入院)、12.9%(95%CI(-15.6%-32%或 538 例入院)、1.7%(95%CI(-44.7%-28.7%或 72 例入院)、16.7%(95%CI(-13.8%-38.3%或 698 例入院)、10.5%(95%CI(-13.8%-28%或 441 例入院)和-4%(95%CI(-42-19.1%or-168 admissions))的 AECOPD 住院,可归因于 PM2.5,PM10,SO2,NO2,CO和O3的暴露。结果表明,在非供暖季分别有19.5%(95%CI(5.6%-30.7%或 979 例入院)、22.4%(95%CI(6.1%-36%或 1127 例入院)、15%(95%CI(-4.2%-29.8%或 754 例入院)、8.3%(95%CI(-20-28.1%或418 例入院)、10.4%(95%CI(-15.3%-30.1%或 522 例入院)、-2.5%(95%CI(-27.5-18.2%或-125 例入院))的 AECOPD 住院,可归因于 PM2.5,PM10,SO2,NO2,O3 和 CO 的暴露。小结:1.在供暖季PM2.5、PM10、NO2、SO2、CO的浓度高于非供暖季;然而在非供暖季O3的浓度高于供暖季。2.在供暖季,每一单位空气污染物中,NO2的累积相对风险最大,而SO2的累积相对风险在非供暖季最大。3.在供暖季节和非供暖季节AECOPD住院的归因负担不同。PM2.5、PM10、NO2和CO是供暖季的主要影响因素,而PM10、PM2.5、SO2和O3是非供暖季的主要影响因素。结论:供暖季和非供暖季引起AECOPD住院的主要空气污染物不同,当政府部门制定干预措施降低慢性阻塞性肺疾病住院风险时,应考虑这些因素对疾病负担的影响。第三部分 IL37对细颗粒物诱导支气管上皮细胞外基质沉积的作用和机制目的:本研究的目的是在细胞模型中观察PM2.5对人支气管上皮细胞细胞外基质沉积的影响,进一步分析在细胞外基质沉积中WNT-5A表达水平的改变。IL-37、WNT-5A siRNA是否可以部分抑制WNT-5A的表达,减弱PM2.5刺激下支气管上皮细胞细胞外沉积的影响,并探讨WNT-5A与氧化应激、炎症反应通路的关系。方法:在细胞模型的研究中,首先用不同浓度的PM2.5干预人气道上皮细胞16HBE24小时,用Western Blot方法检测WNT-5A的表达,根据WNT-5A的表达选取最佳PM2.5的浓度,将16HBE细胞分为正常对照组,PM2.5组。细胞接受PM2.5刺激24小时,用Western Blot检测fibronectin,NRF2,WNT-5A的表达,细胞免疫荧光方法进一步验证WNT-5A的表达,用荧光法检测线粒体产生和释放的反应性氧化物,用ELASA方法观察IL6,IL-Iβ的表达。然后,用WNT-5A的siRNA特异性敲除WNT-5A基因和IL-37干预后再给予PM2.5刺激来观察WNT-5A的表达,观察其是否能够下调fibronectin,Nrf2的表达以及炎症因子IL6,IL-1β的表达。结果:1.不同浓度的PM2.5刺激16HBE细胞WNT-5A的表达:给予不同浓度的PM2.5干预16HBE24小时后,Western Blot分析不同浓度的PM2.5刺激WNT-5A的表达较对照组明显增加(P<0.05);PM2.5在12.5μg/ml刺激时相比于对照组和其它浓度下WNT-5A表达明显增加(P<0.001)。2.在PM2.5(12.5μg/ml)刺激16HBE细胞fibronectin,Nrf2的表达:PM2.5干预 16HBE24 小时后,Western Blot 分析PM2.5在 12.5μg/ml刺激HBE细胞相比于对照组Fibronectin、Nrf2表达明显增加(P<0.000)。3.WNT-5A的免疫荧光表达:倒置显微镜下可以观察到PM2.5干预组细胞胞质中可见许多明亮的绿色荧光,进一步证实了 PM2.5可以使WNT-5A表达增加与Western Blot结果相符。4.炎症因子IL6、IL-1β的释放:给予不同浓度的PM2.5干预16HBE24小时后,用ELISA法检测分析不同浓度的PM2.5刺激的IL6、IL-1β的释放较对照组明显增加(P<0.001);PM2.5在12.5μg/ml刺激时相比于对照组和其它浓度下IL6、IL-1β的释放明显增加(P<0.001)。5.PM2.5刺激活性氧的产生:给予不同浓度的PM2.5干预16HBE24小时后,用DCFH-DA荧光强度检测分析不同浓度的PM2.5刺激活性氧的产生较对照组明显增加(P<0.01);PM2.5在12.5μg/ml刺激时相比于对照组和其它浓度下活性氧产生明显增加(P<0.01)。6.IL37干预后WNT-5A的免疫荧光表达:IL37干预后再给予PM2.5刺激,IL37干预组细胞中绿色荧光较PM2.5组下降。7.IL37干预后WNT-5A、fibronectin、Nrf2 的表达:IL37 干预后再给予 PM2.5 刺激,Western Blot分析给予IL37干预组WNT-5A、fibronectin、Nrf2的表达较PM2.5组下降(P<0.05)。8.IL37干预后抑制IL6、IL-1β的释放:IL37干预后再给予PM2.5刺激,IL37干预组IL6较PM2.5组下降(P<0.01);IL-1β也较PM2.5组下降(P<0.001)。9.IL37干预后活性氧的产生:IL37干预后再给予PM2.5刺激,IL37干预组活性氧的产生较PM2.5组下降(P<0.001)。10.WNT-5A siRNA转染后WNT-5A的免疫荧光表达:WNT-5A siRNA组细胞中绿色荧光较阴性Scrambled siRNA组下降;PM2.5刺激的siRNA组细胞中绿色荧光较Scrambled siRNA组下降。11.WNT-5A siRNA转染后WNT-5A、fibronectin、Nrf2的表达:WNT-5A siRNA 组 Western Blot 分析WNT-5A、fibronectin、Nrf2的表达较 Scrambled siRNA 组下降(P<0.001);PM2.5刺激的WNT-5A siRNA组fibronectin、Nrf2的表达较Scrambled siRNA 组下降(P<0.001)。12.WNT-5A siRNA 转染后 IL6、IL-1β的释放:WNT-5A siRNA 组 IL6、IL-1β 的释放较对照 Scrambled siRNA 组下降(P<0.001);PM2.5刺激的WNT-5A siRNA组IL6、IL-1β的释放较Scrambled siRNA 组下降(P<0.001)。13.WNT-5A siRNA 转染后活性氧的产生:WNT-5A siRNA组活性氧的产生较对照Scrambled siRNA组下降(P<0.001);PM2.5刺激的WNT-5A siRNA组活性氧的产生较Scrambled siRNA 组下降(P<0.001)。小结:在体外细胞模型中,PM2.5可以诱导WNT-5A的表达升高,加重细胞外基质沉积,可能通过炎症通路,氧化应激通路来调控细胞外基质。WNT-5A siRNA和IL37可以减轻炎症反应,氧化应激下调WNT-5A的表达,为治疗PM2.5诱导的细胞外基质沉积提供治疗靶点。