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目的：克隆申克孢子丝菌的过氧化氢酶编码基因,探讨过氧化氢酶在体外申克孢子丝菌抗氧化损伤中的作用。
方法：根据已知真菌过氧化氢酶氨基酸序列的高度保守区域设计简并引物,应用简并:PCR结合快速扩增cDNA术端(RACE)技术,克隆申克孢子丝菌过氧化氢酶基因的cDNA全序列。应用TaqMan荧光实时定量RT-PCR方法,对体外申克孢子丝菌由菌丝相向酵母相转换以及在H2O2应激中,其过氧化氢酶的mRNA表达水平进行动态观察。
结果：克隆了申克孢子丝菌的过氧化氢酶同源基因,并将其命名为Sscat基因。Sscat基因的cDNA全序列长1764 bp,其中包括5’端121 bp的非编码区、1500 bp的编码区和109 bp的3’端非编码区。该基因编码499个氨基酸,分子量为56.07 kDa,其氨基酸序列与蛋白质数据库中其他真菌过氧化氢酶的氨基酸序列有较高的同源性,其中与米曲霉、黑曲霉、棒曲霉的同源性分别为66.3％、56.6％和55.1％。Sscat基因包括1个内含子和2个外显子。体外研究显示,在菌丝相向酵母相转换(36℃培养)中,Sscat基因的mRNA表达水平不同。与菌丝相(25℃培养)比较,36℃培养的第12h,其表达水平轻度增高；24h的表达水平略有下降,差异均具有统计学意义(p<0.05);48h和72h的表达水平升高,分别为菌丝相(25℃培养)的2.8倍和8.7倍(P<0.01)。经4mM H2O2诱导后,酵母相Sscat的mRNA表达水平在30min即开始升高；2h达最高值,为非H2O2诱导组(0h)的6.3倍；3～7h缓慢下降,但仍然保持在较高的水平。除了H2O2诱导后15min以外,30min～7h其他各时间点的表达水平均高于0h(P<0.01)。结果表明,在体外双相转换过程中以及H2O2应激中,申克孢子丝菌的过氧化氢酶同源基因Sscat的mRNA发生了保护性高表达。
结论：成功克隆了申克孢子丝菌的过氧化氢酶同源基因Sscat的cDNA全序列。在体外双相转换过程中以及H2O2应激中,申克孢子丝菌Sscat基因的mRNA发生了保护性高表达,表明过氧化氢酶在体外申克孢子丝菌的抗氧化损伤中发挥作用,推测其对申克孢子丝菌在宿主体内感染过程中的存活可能起保护作用。