背景:脂肪移植术已广泛用于美容和重建手术中的软组织填充,但存在移植后不确定重吸收（例如30%-70%的重吸收）、有限的存活率以及对供体部位不可避免的伤害等缺陷。商业化的透明质酸和胶原蛋白可以用作软组织填充产品,但是它们的填充效果不能长期保持。因此,迫切需要开发一种作为永久性软组织填充剂的可注射产品。脱细胞脂肪组织（decellularized adipose tissues,DAT）支架具有与脂肪组织细胞外基质相似的生物学特性,包括结构,机械模量和蛋白质组成。基于DAT的优势,DAT已在脂肪组织工程学中得到了广泛的研究。但是,进一步改善DAT的血管生成将有利于DAT的脂肪形成。此外,DAT水凝胶的可注射性更适合于微创填充。因此,我们创造性地使用机械方法从脂肪抽吸物中分离出脂肪组织来源的细胞外囊泡（adipose tissue derived extracellular vesicles,AT-EVs）作为血管生成和脂肪生成的诱导剂,并制备了富含AT-EVs的DAT水凝胶用于组织工程脂肪。方法:本研究分为两个部分,其一是AT-EVs和DAT的获取和表征。首先采用CD63-perilipin免疫荧光染色法检测AT-EVs在脂肪组织中的分布;然后通过匀浆并反复冷冻和融化（下文简称为冻融）从脂肪抽吸物中获取脂肪组织提取液（Adipose liquid extract,ALE）和少脂质脂肪组织。通过差速离心法从ALE中分离出AT-EVs,使用透射电镜、Nano Sight粒径分析、western blotting对AT-EVs进行表征。DAT水凝胶是通过优化的脱细胞技术制备的,使用扫描电镜对DAT水凝胶进行表征。其二是联合AT-EVs与DAT水凝胶构建工程组织脂肪。首先是通过将三个不同浓度的AT-EVs与血管内皮细胞和3T3-L1脂肪祖细胞共培养,筛选出AT-EVs促进血管生成和脂肪生成的最佳剂量。然后以最佳剂量与DAT水凝胶混合,将富集AT-EVs的DAT水凝胶注射到重度免疫缺陷小鼠-SCID小鼠的右背部皮下,并在左侧背部皮下注射等体积的DAT水凝胶作为对照组。术后第14天,将AT-EVs补充注射到右侧背部的新生组织中,并向左侧背部注射相同量的PBS溶液作为对照。在术后第2、4和8周收集两侧的样品,并进行体积测量、HE染色以及CD31-perilipin免疫荧光染色。结果:经CD63-perilipin免疫荧光染色发现,在脂肪组织的细胞间隙中存在AT-EVs,通过组织匀浆后差速离心,我们可以获取结构为圆形双层膜囊、颗粒粒径在33.0～272.5 nm之间,峰粒径为141.5 nm、与脂肪组织相比,表达较高的EVs表面标记物（CD63和TSG101）,不表达细胞骨架蛋白（β-actin）和细胞外基质蛋白（纤维连接蛋白）的AT-EVs。脂肪组织经脱细胞之后,SEM显示DAT主要由排列松散的条纹状胶原构成,多孔,未见脂滴和细胞核。制备成DAT水凝胶后,SEM示微观结构更致密,孔隙更多,孔径明显小于DAT。体外实验示,AT-EVs促进血管生成和脂肪生成的最佳剂量为50μg/ml。在体内实验中,结果显示实验组水凝胶在术后第4周和第8周体积保留率高于对照组。CD31荧光染色示实验组水凝胶血管新生高于对照组在术后第2周、第4周和第8周。HE染色、perilipin荧光染色示实验组水凝胶脂肪新生高于对照组在术后在第4周和第8周。结论:新机械方案可以在不通过体外培养的条件下获取AT-EVs,且富含AT-EVs的DAT水凝胶可促进血管生成和脂肪生成,并可以作为脂肪组织工程学的有前途的生物材料。