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第一部分2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用目的:既往研究表明2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-(-2-benzofuranyl)-2-imidazoline,2-BFI)在多种病理生理过程中参与抗氧化、抗炎症、抗凋亡。但是2-BFI在脊髓损伤模型中的作用尚不清楚。因此本实验采用钳夹法建立脊髓损伤(spinalcord injury,SCI)大鼠模型并利用该模型探讨2-BFI在脊髓损伤大鼠模型中潜在作用。方法:实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:(1)假手术组(Sham组);(2)对照组(SCI+vehicle组);(3)实验组(SCI+2-BFI组)。参照既往文献,建立了脊髓损伤大鼠实验模型。将大鼠麻醉后俯卧位固定置于专用手术台上。取后正中切口,从T10椎板到T12椎板行椎板切除术,充分暴露脊髓。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。对照组及实验组大鼠利用70g闭合力Yasargil动脉瘤夹钳夹脊髓60秒,损伤成功的指标包括局部脊髓出现红肿、压迫后双后肢立即抽动、大鼠清醒时双侧后肢麻痹。药物注射(2-BFI腹腔注射3 mg/kg或0.9%生理盐水,每日2次,共3日)由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。所有大鼠在造模后第1、2、3、7、14、21天进行神经功能评估。神经功能评估采用BBB(Basso、Beattie and Bresnahan)神经功能评分量表,评分范围从0分到21分。结果:SCI大鼠运动神经功能采用BBB运动能力评定量表进行评定。假手术组术后即刻、术后1-3天、7天、14天、21天得分均为21分。在SCI发生后第1天,对照组和实验组的BBB运动能力评分均迅速下降,分别为0.17±0.41及0.17±0.41,相对于假手术组,两组的BBB评分呈显著性下降(p<0.05),但两组之间并无统计学差异(P>0.05)。虽然在SCI发生后第3天,实验组的BBB评分高于对照组,分别为2.00±1.09及1.33±0.82,但两组之间仍无统计学差异(P>0.05)。但在SCI发生后第7天,实验组的BBB评分则高于对照组,且两者差异存在统计学意义(分别为4.33±0.52及3.33±0.52,p<0.05)。同样的结果也出现在SCI发生后第14天,实验组的BBB评分明显高于对照组(6.17±0.98及4.67±0.822,p<0.05)。将观察期延迟到SCI发生后的第21天,实验组的BBB评分明显大于对照组,且两组之间的差距更加明显(8.00±1.10及 6.17±0.98,p<0.01)。结论:通过2-BFI处理后SCI大鼠的BBB评分明显高于对照组,说明腹腔注射2-BFI(3mg/kg)后可显著改善SCI后BBB神经功能评分,在脊髓损伤大鼠模型中具有神经保护作用。第二部分 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)大鼠模型并利用该模型证实 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-(-2-benzofuranyl)-2-imidazoline,2-BFI)对脊髓损伤大鼠的神经保护作用,并探讨2-BFI神经保护作用机制。方法:根据第一部分实验结论的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:(1)假手术组(Sham组);(2)对照组(SCI+vehicle组);(3)实验组(SCI+2-BFI组)。SCI+vehicle组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;SCI+2-BFI组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3 mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠(100mg/kg)深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200m14℃0.9%生理盐水灌洗。Western blot检测Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白。使用ELISA试剂盒,对脊髓组织样本中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性进行检测。FJB染色和TUNEL染色检测损伤部位周围脊髓组织的细胞坏死和凋亡。结果:与假手术组相比,对照组SOD和GPx活性均明显降低(P<0.01)。同时,SOD和GPx活性在使用2-BFI后明显升高(P<0.05)。脊髓损伤大鼠脊髓组织中Bax蛋白及cleaved caspase-3蛋白水平(p 19和p 17)明显升高,Bcl-2蛋白水平明显降低(P<0.01和P<0.05)。而2-BFI的应用显著提高了 SCI后Bcl-2蛋白水平(P<0.01),Bax蛋白和cleaved caspase-3蛋白水平(p19和p17)都被下调。与此同时,对照组与假手术组相比,Bcl-2/Bax比值在SCI后明显降低,而在使用2-BFI后,实验组较对照组Bcl-2/Bax比值明显升高(P<0.01)。假手术组脊髓切片未见FJB阳性或TUNEL阳性细胞,然而在对照组中可见大量FJB阳性细胞和TUNEL阳性细胞,使用2-BFI治疗后FJB阳性细胞和TUNEL 阳性细胞数量显著降低(P<0.05和P<0.01)。结论:2-BFI的应用上调SOD和GPx的活性,上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白和cleaved caspase3(p17和p19)蛋白的表达,进一步证实其神经保护作用。此外,FJB染色和TUNEL染色显示细胞坏死和凋亡水平降低也佐证了 2-BFI的神经保护作用。综上所述,这些结果提示2-BFI可能通过抑制氧化应激反应和细胞凋亡坏死来减轻脊髓损伤,从而提高脊髓损伤后的功能恢复。第三部分 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中神经保护作用的调节机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)大鼠模型并利用该模型证实 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-(-2-benzofuranyl)-2-imidazoline,2-BFI)是否通过激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶(Nrf2/HO-1)信号通路,引起下游抗氧化、抗凋亡相应蛋白变化从而保护神经细胞。方法:根据第二部分实验结果的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:(1)假手术组(Sham组);(2)对照组(SCI+vehicle组);(3)实验组(SCI+2-BFI组)。对照组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;实验组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠(100mg/kg)深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200ml4℃0.9%生理盐水灌洗。Westernblot检测Nrf2、HO-1和NQO1蛋白。利用免疫荧光染色技术定位Nrf2蛋白,观察损伤部位周围脊髓组织神经元细胞和星形胶质细胞中的Nrf2表达量变化。结果:与假手术组相比,对照组和实验组脊髓组织中无论Nrf2蛋白还是HO-1蛋白都有明显升高(P<0.01),而与假手术组相比,对照组NQO1蛋白表达降低(P<0.01)。此外,与对照组相比,实验组Nrf2和HO-1进一步显著升高(P<0.01)。但对照组与实验组NQO1表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光染色显示,Nrf2蛋白无论在神经元细胞还是星形胶质细胞中的表达,对照组及实验组均显著高于假手术组(P<0.01)。此外,实验组神经元细胞内、星形胶质细胞内Nrf2水平明显高于对照组(P<0.01)。结论:脊髓损伤后2-BFI处理增加了 Nrf2蛋白和HO-1蛋白的表达,表明2-BFI可激活Nrf2/HO-1信号保护脊髓损伤后的神经细胞。总之,这些结果为2-BFI通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻脊髓损伤,提高脊髓损伤后的功能恢复提供了有力证据。