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甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常见的分化型甲状腺恶性肿瘤,PTC发病率在所有癌症类型中增长最快,虽然治疗后五年总生存率可达98%,但仍有部分患者在经外科治疗或者放化疗后出现癌细胞浸润到周围淋巴组织,导致死亡率的增加。因此有必要了解甲状腺癌发病分子和遗传学机制,探索新的治疗靶点。TFF3属于三叶因子(TFFs)家族,越来越多研究表明TFF3在多种肿瘤细胞中异常表达并参与肿瘤细胞扩散,侵袭和凋亡等多种生物学行为。高表达TFF3可以通过激活MAPK,ERK,PI3K/AKT等多种信号通路进而调节癌症进程,而TFF3对PTC的恶性生物学行为的调控和信号转导机制研究甚少。课题小组前期研究结果发现,当敲低内源性TFF3表达后,TPC-1细胞生长迟滞,侵袭能力下降与细胞阻滞于G0/G1期有关。在基于课题小组前期研究结果上,进一步明确TFF3差异表达对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞恶性生物学行为的影响及信号转导机制,为TFF3作为PTC治疗的潜在靶点基因和有效靶向抑制剂开发提供治疗策略。首先构建TFF3基因过表达以及敲低表达的慢病毒表达载体,通过慢病毒转染TPC-1细胞,收获稳定增强TFF3基因表达的TFF3-TPC-1细胞和增强对照组细胞Con TFF3-TPC-1;抑制TFF3基因表达的sh RN A-TFF3-TPC-1细胞和沉默对照组细胞sh Con-TPC-1;利用Real-time PCR(RT-PCR)以及Western Blot验证TFF3过表达及沉默效率。通过生长曲线和克隆形成实验检测TFF3-TPC-1,Con TFF3-TPC-1,sh RNA-TFF3-TPC-1,sh Con-TPC-1四组细胞增殖水平;流式细胞术检测四组细胞凋亡率;Western Blot和免疫细胞化学染色法(ICC)检测PI3K/AKT,NF-κB通路蛋白及凋亡相关蛋白Akt,p-Akt,NF-κB-p65,Bcl-2,Bax,细胞色素C(Cyt-c),cleaved-Caspase-9,cleaved-Caspase-3表达水平。以上实验结果显示(1)TFF3-TPC-1细胞的增殖速度和克隆形成能力显著高于对照组Con TFF3-TPC-1(P<0.05或P<0.01),sh RNA-TFF3-TPC-1细胞增殖速度和克隆形成能力显著低于对照组sh Con-TPC-1(P<0.01);(2)TFF3-TPC-1细胞凋亡率低于对照组Con TFF3-TPC-1(0.75%±0.08%VS 5.62%±0.3%,P<0.01),sh RNA-TFF3-TPC-1凋亡率高于对照组sh Con-TPC-1(22.2%±1.2%VS5.34%±0.4%,P<0.01);(3)与对照组相比,增强TFF3基因表达后Bax,Cyt-C,cleaved-Caspase-9,cleaved-Caspase-3表达下调,上述蛋白表达在沉默TFF3基因后被上调,Bcl-2,Akt,p-Akt,NF-κB-p65表达在增强TFF3基因表达后被上调,在沉默TFF3基因表达后被下调(P<0.05或P<0.01)。为进一步明确PI3K/AKT/NF-κB通路在PTC进程中的作用,进一步设置TFF3-TPC-1细胞株为过表达组;不做任何处理的野生型TPC-1细胞株作为Control组;经不同浓度的PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002(25μmol/L,50μmol/L,75μmol/L)干预培养的TFF3-TPC-1细胞株作为实验组,细胞培养48h。倒置显微镜观察各组细胞的形态变化和生长状态;生长曲线比较各组细胞的增殖水平;Transwell和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡;Western Blot检测各组细胞中p-Akt,p-IκB-α,IκB-α,NF-κB-p65,cleaved-Caspase-3,cleaved-Caspase-9,Bcl-2,Bax蛋白表达量。结果显示:(1)形态学观察:过表达组和Control组细胞呈上皮样,外形无明显差别。经LY294002干预培养后的实验组细胞随着LY294002培养浓度增加,细胞间隙变大,圆形透亮的细胞增多;(2)与Control组相比,过表达组细胞融合率,侵袭能力和迁移指数高于Control组,细胞凋亡率低于Control组(0.89%±0.03%VS 2.4%±0.06%,P<0.05或P<0.01);(3)实验组细胞融合率,侵袭和迁移指数方面低于Control组,细胞凋亡率高于Control组(6.22%±0.02%,10.8%±0.02%,24%±0.07%VS 2.4%±0.06%,P<0.05或P<0.01);(4)Western Blot显示:与Control组相比,通路蛋白和抗凋亡蛋白p-Akt,p-IκB-α,NF-κB-p65,Bcl-2随着LY294002浓度增加被下调,促凋亡蛋白IκB-α,cleaved-Caspase-3,cleaved-Caspase-9,Bax表达升高;过表达组通路蛋白和抗凋亡蛋白表达量高于Control组,而促凋亡蛋白表达低于Control组(P<0.05或P<0.01)。综上研究结果揭示了TFF3可以通过影响PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖,抗凋亡的恶性生物学行为;PI3K靶分子抑制剂LY294002可以有效抑制PI3K/AKT通路转导,其抑制效应是通过抑制Akt磷酸化有效下调NF-κB信号通路活性,进而抑制TFF3-TPC-1细胞增殖,侵袭和迁移并诱导其凋亡。这为临床甲状腺癌的靶基因治疗以及靶分子抑制药物开发提供理论支持。