甘薯IbWRKY44和IbWRKY75基因的克隆及功能研究

来源 :山西农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xukaiboy123
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WRKY转录因子在植物的生长发育、逆境胁迫响应、次生代谢等方面发挥着重要作用,利用生物信息学和分子生物学手段解析甘薯WRKY转录因子的功能,对培育抗逆性良好、品质高的甘薯新品种具有重要意义。本研究分别从‘徐紫薯3号’和‘徐薯18号’中克隆了Ib WRKY44和Ib WRKY75基因,并对他们的生物学功能进行了初探。首先对Ib WRKY44和Ib WRKY75的氨基酸序列进行了生物信息学分析和系统进化分析,对Ib WRKY44和Ib WRKY75基因的启动子序列进行了顺式作用元件分析。其次,对Ib WRKY44在紫薯和非紫薯块根中的表达模式以及Ib WRKY75在不同发育时期叶片和PEG、Na Cl处理前后的不同组织中的表达特性进行了实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析。然后构建了35S::Ib WRKY44::GFP和35S::Ib WRKY75::GFP表达载体,并使它们在烟草叶片中瞬时表达,进行亚细胞定位;同时将35S::Ib WRKY44::GFP转化拟南芥和‘徐薯18号’的胚性悬浮细胞。此外,还构建了Ib WRKY44的CRISPR/Cas9敲除表达载体,并将其转化‘徐紫薯3号’的胚性悬浮细胞。主要结果如下:1、Ib WRKY44基因的相关结果从‘徐紫薯3号’成功克隆了Ib WRKY44基因,其ORF长1401 bp,编码446个氨基酸。Ib WRKY44基因编码的蛋白含有2个WRKY结构域,锌指结构为C2H2型,属于Group I类WRKY转录因子,为碱性不稳定疏水性蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域,具有WRKY转录因子典型的4β折叠结构。在进化关系上,Ib WRKY44与拟南芥WRKY家族中的At WRKY44相似性最高,与茄科马铃薯和番茄的WRKY44亲缘关系较近,与同属于旋花科的甘薯二倍体三叶裂薯和牵牛的WRKY44亲缘关系最近。Ib WRKY44的启动子中存在植物激素响应元件、光诱导元件和厌氧诱导元件等多种特异性顺式作用元件以及AP1、MYB和MYC等转录因子的结合位点,推测Ib WRKY44的转录可受这些因子的激活或抑制,进而广泛调控植物的生长发育。Ib WRKY44定位于细胞核。Ib WRKY44在紫薯块根中表达量显著高于非紫薯块根,推测其参与甘薯花青素的合成。遗传转化共获得了11株Ib WRKY44的过表达转基因拟南芥株系,其T0代种子种皮颜色变浅,种子体积增大,表明Ib WRKY44可能参与了拟南芥种子的发育和其种皮中原花青素的合成。2、Ib WRKY75基因的相关结果从‘徐薯18号’成功克隆的Ib WRKY75基因,其ORF长597 bp,编码198个氨基酸。Ib WRKY75基因编码的蛋白中含有1个WRKY结构域,其锌指结构为C2H2型,属于Group II类WRKY转录因子,为碱性不稳定疏水性蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域,具有4β折叠结构。在进化关系上,Ib WRKY75与旋花科牵牛的In WRKY75亲缘关系最近,与大豆Gm WRKY53和蓖麻Rc WRKY75等亲缘关系较近。Ib WRKY75的启动子中存在多种特异性顺式作用元件,如ABRE、CGTCA-motif等植物激素响应元件和AE-box、Box 4等光诱导元件等,此外,还存在MYB和MYC转录因子的结合位点,推测Ib WRKY75的转录可受这些因子的激活或抑制,进而在这些因子介导的生物学调控网络中广泛发挥作用。Ib WRKY75定位于细胞核。Ib WRKY75基因在甘薯的根、茎、叶和叶柄中均有表达,表达量依次为茎>叶>根>叶柄;PEG和Na Cl诱导Ib WRKY75的表达量上调,在根中的上调幅度最显著;Ib WRKY75的表达量随着叶片的自然衰老而逐渐增加。因此,推测Ib WRKY75基因在甘薯对干旱和高盐的胁迫响应中发挥作用,而且参与甘薯的形态建成和叶片衰老进程。综上,Ib WRKY44和Ib WRKY75在甘薯的花青素合成方面和生长发育、形态建成以及逆境胁迫响应等方面分别发挥调控作用,此结果将为解析植物地下部花青素合成机制提供理论基础,为甘薯抗逆品质的遗传改良提供分子靶标,对甘薯产业的发展具有重要的理论和实践意义。
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