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烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的病毒病害是我国烟草安全生产的重大威胁。为明确TMV,CMV,TEV和PVY在我国烟草产区的分布、分子变异等信息,本研究在我国12个烟草主产区展开病毒病害的调查与分析。在此基础上,进一步研究了植物提取物WCT-II的抗病毒活性和作用机理,为开发环境友好型植物病毒的防控技术提供了理论和物质基础。2010和2011年,本实验在我国12个烟草主产区共采集409份样品,利用DAS-ELISA和RT-PCR等技术对这些样品进行了分析。检测结果表明TMV,CMV,TEV和PVY广泛分布在我国12烟草主产区,平均检出率在50%以上。不同地区,病毒检出率呈现了多样性。陕西省烟草产区病毒危害最重,平均检出率为75.95%;其次为河南,检出率为74.78%;湖南检出率为74.26%;湖北最轻,检出率为58.69%。这些地区已经是烟草病毒病危害最为严重的地区,严重威胁当地烟草及其他经济作物的安全生产,因此有效控制病毒病的危害已经成为一项紧迫任务。在不同年份,这四种病毒的检出率也有差异。统计2010年和2011年的调查结果显示,烟草病毒在2010年平均检出率为76.62%,明显高于2011年的60%。这说明烟草病毒的检出率呈现动态的变化趋势,这可能与气候、农事活动等因素有关,因此多年份、多区域的调查才能较为真实的反应烟草病毒的危害情况。本实验从采集的样品中共分离鉴定到18个TMV分离物,21个CMV分离物,15个TEV分离物,21个PVY分离物。与在线数据比对显示,这四种病毒外壳蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列的一致率分别为:TMV是97%~100%和72%~100%,CMV为81%~100%和78%~100%,TEV为96%~100%和97%~100%,PVY为96%~100%和97%~100%。以这些分离物为基础,结合数据库在线数据,采用RDP4软件对这些分离物的外壳蛋白核苷酸序列进行了重组分析。3个明显的重组事件从这些分离分离物中鉴定得到,其中CMV分离物中鉴定出1个,TEV分离物中鉴定出1个,PVY分离物中鉴定出1个。Phylogenetic network分析结果表明CMV,TEV和PVY的分离物呈现非树形的Phylogenetic network树,说明重组对CMV,TEV和PVY遗传变异起着重要的作用,是影响CMV,TEV和PVY种群变异的重要因素。此外,利用MEGA软件计算了这些分离物的non-synonymous和synonymous sites(d N/d S比值)的比值。结果显示TMV,CMV,TEV和PVY分离物外壳蛋白的d N值明显小于d S值,即d N/d S ratio小于<1,说明TMV,CMV,TEV和PVY分离物的外壳蛋白基因受到负向选择的影响。负向选择也是影响四种烟草病毒种群变异的重要因素。基于TMV,CMV,TEV和PVY外壳蛋白的核苷酸序列,利用MEGA4软件,系统分析这四种病毒的遗传变异。依据TMV分离物建立的系统发育树,34个TMV分离物(16个来自网上公布的序列)被分成了两个亚组,Group I和II(bootstrap support values>60%)。38个CMV分离物分到了Subgroup I,5个CMV分离物分到了Subgroup II。39个TEV分离物(24个来源于数据库)被分成了四个组,Groups I,II,III和IV(bootstrap support values>90%)。73个PVY分离物(52个来源于网上数据库)被分成了2个组,Group I和II(bootstrap support values>90%)。该结果表明TMV,CMV,TEV和PVY分离物存在明显的遗传变异。为进一步分析这些分离物的多样性,本实验采用MEGA4软件分别计算了这些分离物组内和组间的遗传距离,结果表明组间的遗传距离明显大于组内的。这说明,组间的遗传多样性要大于组内的,进一步说明这四种病毒分离物存在明显的遗传多样性。有效的防治这些烟草病毒病已经成为了一大难题。针对这一难题,本实验采用半叶枯斑法、定量PCR等技术检测了生物源活性物质WCT-II抗TMV的活性、作用机理。在WCT-II处理普通烟草(Nicotiana tabacum)后,本实验采集了烟草叶片,测量了SOD酶、POD酶、PPO酶活性、过氧化氢含量的变化及PR-1基因表达量差异。目前实验结果表明,与对照组相比,WCT-II处理6 h后,SOD酶、POD酶、PPO酶活性及过氧化氢含量开始上升,同时,PR-1基因开始被诱导表达;12 h后,PPO活性和SOD活性出现峰值;在处理24 h后,POD酶活性出现峰值;PR-1基因表达量达到高峰,为对照组烟草的3.16倍;过氧化氢含量也达到高峰。随后,SOD酶、POD酶、PPO酶活性、过氧化氢含量的及PR-1基因表达量均逐渐下降到对照水平。该实验说明在温室条件下,WCT-II可以通过有效诱导烟草SOD酶、POD酶、PPO酶活性上升,诱导过氧化氢大量积累和PR-1基因的上调表达,最终诱导烟草产生抗TMV的活性。TMV,CMV,TEV和PVY在我国烟草主产区广泛分布,引起的病毒病害已经成为危害我国烟草安全生产的重要因素。这些病毒分离物存在明显的遗传变异,重组和负向选择是影响这些病毒类群遗传变异的重要因素。作为植物源活性物质,WCT-II能有效诱导烟草产生系统的抗病性,为有效防治TMV,CMV,TEV和PVY等烟草病毒提供了理论和物质基础。